食品中致病菌的初筛鉴定和污染源的追溯.ppt

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1、食品中致病菌的初筛鉴定和污染源的追溯------分子生物学技术在食品检验中的应用张志坤2009.3.10大纲一.概述二.致病菌的初筛及鉴定系统(一).目前食品安检中致病菌常规的检测方法(二).常规检测方法的优缺点(三).食品微生物检测的发展趋势(四).分子生物学理论基础(五).分子生物学检测技术---PCR技术和Real-TimePCR技术详解(六).分子生物学检测技术---生物芯片技术（探针技术）简介(七).分子生物学检测技术的优缺点(八).分子生物学鉴定技术简介三.致病菌污染源的追溯系统(一).概述(二).目前常用的污染源追溯方法

2、---PFGE电泳方法简介(三).DuPont公司RiboPrinter®System简介一.概述微生物检测常规微生物检测致病微生物检测常规微生物项目：细菌总数、大肠菌群、大肠杆菌、酵母总数、霉菌总数，此类细菌不致病，但会严重影响食品的外观及风味。目前常用微生物培养法来计数菌落，允许有该类菌落，但菌落总数不能超标。致病微生物项目：沙门氏菌、李斯特菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌O157：H7、弯曲杆菌、致病弧菌、副溶血弧菌、志贺氏菌、假单胞菌等。致病微生物在食品中是绝对不允许存在的，所以快速检测食品中是否存在有致病微生物，是食品安全检验的重

3、中之重。下面我们重点来谈一下致病菌的检验方法。食品微生物检测一.概述食品中致病微生物的检测致病微生物检测致病微生物检出及鉴定污染源的追溯为什么要进行污染源的追溯?1.可以搞清楚致病菌污染的源头,进而分析出污染爆发的原因;2.可以更为有效地消除污染源,杜绝污染的再次爆发;3.在食品生产的各个环节可以有效地进行质控.二.初筛及鉴定常规检测步骤：收集样品无选择性富集细菌（4-8小时）选择性的富集增菌（18-24小时）1.平板培养纯化细菌，根据菌落形态，生理生化特征等检测。2.免疫检测收集样品富集细菌选择增菌培养检测免疫检测(一).目前食品安检

4、中致病菌常规的检测方法二.初筛及鉴定1.生物梅里埃选择性培养基平板法（1）.chromID™阪崎肠杆菌显色平板2种显色底物用来显示2种阪崎肠杆菌的特异性酶活性：α-D-吡喃葡萄糖苷酶glucopyranosidaseandβ-D-纤维二糖酶,并可以检测低活性的α-D吡喃葡萄糖苷酶菌株。抗生素用来抑制大多数革兰氏阳性菌、酵母菌和一些革兰氏阴性菌的生长24小时培养后获得典型的菌落（蓝灰色到蓝黑色），48小时培养后出现特有的菌落形态。因此可以在48小时一次判读结果。35-37°C和41.5°C培养均通过评估，通过评估可在mLST＋新生霉素或E

5、E肉汤增菌培养后使用(FDA/CFSAN:2002)（2）.chromID沙门菌显色平板特异性:3种显色底物能更好地选择性分离和区分包括伤寒沙门氏菌、副伤寒沙门氏菌和绝大多数乳糖阳性地沙门氏菌在内的沙门氏菌。营养成份:在强选择性成分作用下，沙门氏菌经过37°C18-24小时培养形成较大、边缘不规则、显色明显的菌落。选择性:强选择性确保抑制污染食物的其它菌落如：革兰阳性球菌、酵母菌和大部分非发酵革兰阴性细菌。(一).目前食品安检中致病菌常规的检测方法二.初筛及鉴定2.生物梅里埃免疫检测法---VIDAS系统VIDAS金葡菌肠毒素葡菌肠毒素

6、是引起食物中毒的常见原因。7种不同的血清型可被鉴定。这些毒素蛋白最初仅由金黄色葡萄球菌产生，但目前有报道中间型葡萄球菌和猪葡萄球菌也能产生毒素。尽管葡萄球菌可通过加热破坏，但这些毒素是热稳定性的，可在高温下存活。生物梅里埃采用尖端科技的ELFA技术，运用能更好的捕获抗原的新抗体工作。移去粘附在酶结合抗体上的Fc片断，明显增强了试剂盒的性能。移去Fc片断减少了可能产生潜在错误信号干扰的食物成份和非特异性结合的其它细菌，提高了特异性。释放2个小的Fab’片断优化了抗体的位置，更好地结合抗原，提高了敏感性.VIDASSET2是一个由包含成品试

7、剂和SPR（固项容器）管组成的单剂量试剂。VIDAS全自动仪器进行整个检测步骤并打印结果：阳性或阴性检测食品中的葡萄球菌毒素检测时间:80分钟整个检测周期:少于1天(一).目前食品安检中致病菌常规的检测方法二.初筛及鉴定1.常规检测方法的优点(1).直观由于常规检测方法是用微生物的培养法来进行的，所以此类方法很直观，经过一定时间的培养后，进行菌落形态和细菌形态及细菌生理生化的鉴定，有没有一目了然，非常直观。(2).经济由于常规方法不需要特殊的试剂，显色培养基和普通染色镜检即可完成检验和鉴定，所以成本低廉。2.常规检测方法的缺点(1).周

8、期长由于常规检测用的是微生物的培养法，需要不断的选择性培养纯化，再加上生理生化的鉴定，周期非常长（一周左右）。(2).不能准确鉴定变种致病菌打个比方，常规的鉴定方法就像鉴定一个人一样，先看人群的形态（物以类