重组DNA分子的酶切、连接、转化和筛选.doc

《重组DNA分子的酶切、连接、转化和筛选.doc》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、重组DNA分子的酶切、连接、转化和筛选摘要：本实验利用酶切后的目的片段（500bp）与puc18为材料，运用氯化钙法制备感受态细胞和外源的重组体DNA转入受体菌细胞，经过筛选培养基筛选后得到重组子。关键词：酶切重组筛选前言重组克隆是指含有外源DNA的细胞增殖而产生的细胞群体，或由其经生长、发育和再生而形成的组织、器官、个体。重组克隆的筛选主要依靠DNA载体上的选择标记，加上合适的选择（培养）条件来进行。一是通过选择培养基使只有带外源DNA的细胞才能生长；二是根据选择性遗传标记选择带有目的基因的细胞克隆。1材料与方法1.1材料质粒DNA、目的DNA、E.coli受菌体、质粒p

2、UC18、重组体DNA1.2方法1.2.1PCR法扩增目的片段（CER3A）1.2.1.1PCR反应体系反应物体积/ulPCRTaqmix12.5CER3Ar，CER3Af各1dd水9.5质粒CER3A11.2.1.2PCR扩增条件在PCR仪上设计94℃5min，然后进入循环，循环中第一步为94℃30s，第二步为58℃退火30s，第三步为72℃延伸1min，共进行35次循环，然后再72℃延伸10min以提高产物的扩增率，取出放在4℃条件下终止反应。1.2.2目的片段的电泳将10倍loadingbuffer5ul和25ulPCR产物混匀，在1.2%的琼脂糖凝胶中电泳，分析。1

3、.2.3目的片段的回收通过琼脂糖电泳尽可能将目的DNA片段与其他片段分开，用干净的手术刀，将含目的片段DNA的琼脂糖凝胶块切下，放入2ml离心管称重。根据凝胶重量和浓度，按每100mg琼脂糖加400ml的比例加bufferB2。将离心管置于50℃水浴5~10min，间或混匀，直至胶块完全溶化。在酶切反应体系中加入5倍bufferB2，混匀。将熔化好的溶液全都移到吸附柱，静止2min，8000×g离心30s，倒掉收集管的液体，将吸附管放入同一收集管中。向吸附管中加入加入500ulWashSolution，9000×g离心30s，倒掉收集管中的液体，将吸附管放在同一根收集管中。

4、重复步骤（6）一次。将空吸附柱和收集管放入离心机，12000×g离心2min，打开瓶盖，放置2~5min，挥发酒精。换新的1.5ml离心管，在吸附膜中加入20uldd水（pH≥8.0），温室静置5min，12000×g离心2min，将所得的DNA溶液置于-20℃保存或用于后续实验。反应物体积/ul目的片段15SadⅠ1.5PstⅠ1.510×loadingbuffer10dd水721.2.4目的片段和pUC18质粒的酶切1.2.4.1目的片段的酶切在37℃反应1~2h。1.2.4.2pUC18质粒的酶切反应物体积/ulpUC1815SadⅠ1.5PstⅠ1.510×load

5、ingbuffer10dd水72在37℃反应1~2h。然后将吸取2ul酶切产物，加入10×loadingbuffer1ul和dd水7ul，在1.2%琼脂糖凝胶上电泳，观察并分析结果。1.2.5DNA片段与质粒pUC18的连接（体积的量不确定）反应物体积/ul目的片段5pUC1856×loadingbuffer1T4ligase21.2.6重组体DNA遗传转化与克隆筛选1.2.6.1感受态细胞的制备取对数生长期的大肠杆菌培养物1ml于离心管中7000r/min离心3~5min，倾去上清液后收集菌体置于冰浴中。用1ml预冷的0.05mol/LCaCl2悬浮菌体，于离心管中700

6、0r/min离心3~5min，倾去上清液后收集菌体置于冰浴中。再用1ml预冷的0.05mol/LCaCl2悬浮菌体，冰浴15min，7000r/min离心3~5min，倾去上清液后收集菌体置于冰浴中。加入100ul预冷0.05mol/LCaCl2悬浮后即为感受态细胞，可在4℃下保存一周。1.2.6.2重组体DNA的遗传转化与克隆筛选常温下熔化感受态细胞，加入重组体DNA40ng左右，冰浴30min。42℃热击90s，冰浴5min，加入1mlLB培养基，37℃温育1h。区230ul菌体悬浮培养物加入30ulIPTG和40ulX-gal，混合均匀后在氨苄青霉素的LB固体培养基平

7、板上涂布均匀，注意不要划破平板培养基表面，于37℃温育过夜。挑选重组体细胞克隆：在固体培养基平板上的蓝色菌落为带质粒但不含目的基因片段的克隆；白色菌落为带有目的基因片段或外源DNA的重组克隆。各重组克隆可进一步增殖，用于建立基因文库，或进行外源基因片段的序列分析。2实验试剂与仪器设备2.1实验试剂2.1.1电泳试剂上样缓冲液；TBE缓冲液；2.1.2DNA内切酶EcoRⅠ试剂盒2.1.3T4DNA连接酶2.1.4T4DNA连接酶缓冲液20mmol/LTris-HCl（pH7.6），5mmol/LMgCl2，0.5m