现代生化技术实验.doc

《现代生化技术实验.doc》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、现代生化技术实验二零零五年二月实验一蛋白质的性质（一）蛋白质及氨基酸的呈色反应一、目的：1、了解构成蛋白质的基本结构单位及主要连接方式2、了解蛋白质和某些氨基酸的呈色反应原理3、学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法二、呈色反应（一）双缩腺反应：1、原理：尿素加热至180°C左右，生成双缩豚并放岀一分子氨。双缩腺在碱性环境下能与•结合生成紫红色化合物，此反应称为双缩腺反应。蛋白质分了屮有肽键，其结构与双缩丿I尿相似，也能发生此反应（一切蛋片质或二肽以上的多肽都有双缩聯反应，但有双缩丿I尿反应的物质不

2、一定都是蛋H质或多肽）。可用于蛋白质的定性或定量测定。2、材料与试剂：尿素10g；10%的氢氧化钠溶液250ml；1%硫酸铜溶液60ml；2%卵清蛋白溶液（或鸡蛋清溶液蛋清：水=1:9）3、操作：（1）取少量尿素结晶，放在干燥试管中。用微火加热使尿素溶化。溶化的尿素开始硬化时,停止加热，床素放出姐，形成双缩腺。（2）冷却后，加10%氢氧化钠溶液约lml,振荡混匀，再加1%硫酸铜溶液1滴。观察颜色的变化。（注意避免硫酸铜过量）（3）向另一试管加卵清蛋白溶液约lml和10%氢氧化钠溶液约2ml,摇匀,再

3、加1滴1%硫酸铜溶液2滴，随加随摇。观察颜色的变化。（二）苗三酮反应1、原理：所有的丁氨基酸（除脯氨酸、耗脯氮酸外）都能与前三酮反应生成蓝紫色物质。整个反应分两步，第一步是氨基酸被氧化形成CO?、N&和醛，水合苗三酮被还原成还原型讳三酮；第二步是所形成的还原型即三胴同另一个水合即三酮分了和氨缩合生成有色物质。此反应的适宜条件为5——7,同一浓度的蛋白质或氨基酸在不同PH条件下的颜色深浅不同，酸度过大时共至不显色。2、材料与试剂：蛋片质溶液：2%的卵清蛋白或新鲜鸡蛋蛋清溶液（蛋清：水=1：9）100m

4、l；0.5%甘氨酸溶液80ml；0.1%茹三酗溶液50ml；0.1%讳三酗一乙醇溶液20ml03、操作：（1）取2支试管分别加入蛋白质溶液合甘氨酸溶液Iml,再各加0.5ml0.1%的苗三酮水溶液，混匀，在沸水浴屮加热1—2分钟，观察颜色由粉色变红色再变蓝。（2）在一小块滤纸上滴一滴0.5%甘氨酸溶液，风干后，再在原处滴一滴（）.1%讳三酮乙醇溶液，在微火旁烘干显色，观察紫红色斑点的出现。（三）黄色反应1、原理：含有苯环结构的氨基酸，如酪氨酸和色氨酸，遇硝酸后，可被硝化成黄色物质，该化合物在碱性溶液

5、屮进一步形成深橙色的硝酿酸钠。多数蛋白质分了含有带苯环的氨基酸，所以有黄色反应，苯丙氨酸不易硝化，需加入少量浓硫酸才有黄色反应。2、材料与试剂：鸡蛋清溶液（100ml）：将新鲜鸡蛋的蛋清与水按1：20混匀，然后用6层纱布过滤；大豆提取液（100ml）：将大豆浸泡充分吸胀后研磨成浆状再用纱布过滤；头发;指甲；0.5%苯酚溶液50ml；浓硝酸200ml；0.3%色氨酸溶液10ml；0.3%酪氨酸10ml；10%氢氧化钠溶液100ml3操作：向7个试管屮分别按下表加入试剂，观察各试管出现的现彖，有的试管反

6、应慢可略放置或用微火加热。待各管出现黄色后，于室温逐滴加入10%红氧化钠至碱性，观察颜色变化。管号1234567材料鸡蛋清大豆提指甲头发0.5%苯0.3%色氨().3%酪氨（滴）溶液取液少许少许酚酸酸4444浓硝酸（滴）244040444现象（四）考马斯壳蓝反应1、原理：考马斯亮蓝G250具有红色和蓝色两种色调。在酸性溶液屮，其以游离态存在呈棕红色；当它与蛋白质通过疏水作用结合后变为蓝色。特点：染色灵敏度高，比氨基黑高3倍。反应速度快,约在2分钟左右时间达到平衡,在室温一小时内稳定。在0.0I-1.

7、0mg蛋白质范围内，蛋白质浓度与A595nm值成正比。所以常用来测定蛋白质含量。2、试剂：蛋白质溶液（鸡蛋清：水=1：20）；考马斯亮蓝染液（考马斯亮蓝G25olOOg溶于50ml95%乙醉中，加100ml85%磷酸混匀，配成原液。临用前取原液15ml,加蒸徭水至100ml,用粗滤纸过滤后，嚴终浓度为0.01%o3、操作：取2支试管，按下表操作蛋白质溶液51）蒸馄水（ml）考马斯亮蓝101520.10.95实验（二）蛋白质的性质实验（二）蛋白质的等电点测定和沉淀反丿皿一、蛋片质等电点的测定1、目的：

8、了解蛋白质的两性解离性质；学习测定蛋白质等电点的一种方法。2、原理：蛋白质是两性电解质，蛋白质分了的解离状态和解离稈度受溶液酸碱度影响。当溶液的PH达到一定的数值时，蛋白质颗粒上正负电荷的数目相等，在电场屮，蛋白质既不向阴极移动也不向阳极移动，此时溶液的PH值称为此种蛋白的等电点。不同的蛋白质的等电点各不相同。在等电点时，蛋白质的理化性质祁有变化，可利用此种性质的变化测定备种蛋H质的等电点。3、材料与试剂0.4%酪蛋白醋酸钠溶液200ml（取0.8g酪蛋白，加少量水在