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1、生化技术实验讲义适用专业：生物工程、生物技术北方民族大学生物科学与工程学院编2009年9月实验一鸡卵类粘蛋白提取%1.实验目的：通过粗提鸡卵类粘蛋白，初步掌握粗提蛋白质的方法。%1.实验原理：鸡卵类粘蛋白是由鸡卵清屮制得的一种糖蛋白，它具有强烈的抑制牍蛋白酶的作用，常用于胰蛋白酶的酶学性质的研究。也可将其制成吸附亲和剂，通过亲和层析技术有效地分离与纯化咦蛋白酶。鸡卵类粘蛋片是至今还未能获得单一组分的制品，在电泳行为上常呈不均一性。目前至少已获得4种不同组分，它们在抑制胰蛋片酶的性能上和氨基酸纟H成上没有多大区别，但是在糖蛋白的糖部分（
2、主要为D-甘露糖、D-半乳糖、葡萄糖胺和啡液酸）的含量上则有差别。它们的等电点有一定的范围,大致在pH3.9—4.5。相对分子质量28000o鸡卵类粘蛋白抑制胰蛋白酶的摩尔比为1：1,因此高纯度的鸡卵类粘蛋白1微克能抑制相当于0.86微克的胰蛋白酶（比活力为12000BAEE单位/阳蛋白）。不同来源的鸡卵类粘蛋白末端有很大差异，鸡卵类粘蛋白的N末端为丙氮酸，C末端为苯丙氮酸。鸡卵类粘蛋白在屮性或酸性溶液屮对热和高浓度的腺祁是相当稳定的，而在碱性溶液屮比较不稳定，尤其当温度较高时易迅速失活。鸡卵类粘蛋白除对牛和猪的胰蛋白酶有强烈的抑制作
3、用外，对枯草杆菌蛋白酶也有一定稈度的抑制作用，但对胰凝乳蛋白酶无抑制作用，另外对人的胰蛋白酶也无明显的抑制作用。本实验主要参照Kassel1的方法，先由鸡蛋清经三氯乙酸（TCA）-丙酗溶液处理，除去沉淀物，然示经丙酮分级沉淀获得粗品，再经DEAE-纤维素（二乙基氨基-纤维素）或者葡聚糖凝胶柱层析纯化而得合格产品。%1.试剂与仪器：试剂：1.鸡蛋。2.丙酮3.TCA-丙酮：34.5g三氯乙酸溶于38.3ml蒸馆水,再加入100.5ml丙酮配成150mlTCA-丙酮溶液4.5moi/LNaOH5.5mol/LHC1仪器：1.低速离心机和高
4、速冷冻离心机2・水浴锅3.真空子燥仪%1.实验步骤：1,取一貝鸡蛋，先将蛋的一•端开个小洞，然后将蛋放在100mL量筒上，再将蛋的另一端也开一个小洞,蛋清就会流入100mL最筒里，取45mL蛋清倒入lOOmL小烧杯里。2.25-30*0水浴下不断搅拌,慢慢加入等体积TCA-丙酮溶液，此时其pH约为1-1.5,用5mol/LNaOH调节至pH约3.5,如过碱则用5mol/LHC1调冋pH至3.5,调至pH3.5示，继续搅拌30mino4°C静置80min,3000rpm离心30min,取上清。边搅拌上清边加入4倍体积预冷的丙酮，4°C静
5、置80min,倒掉部分上清（使剩余体积约为80mL）,BOOOrpm离心15min,取沉淀真空干燥（把沉淀交给实验室老师真空干燥）。思考题：1、提取鸡卵类粘蛋白操作过稈屮应注意什么？为什么？2、TCA・丙酮在提取鸡卵类粘蛋白中所起的作用是什么？实验二凝胶过滤层析法纯化鸡卵类粘蛋白%1.实验目的：了解凝胶过滤层析基木原理，学握凝胶过滤层析的基木操作。一，凝胶过滤层析法实验原理：凝胶过滤也称排阻层析，分了筛层析和凝胶层析。凝胶是由胶体溶液凝结而成的固体物质，其内部具有很细微的多孔网状结构。凝胶层析的机理是分子筛效应，当凝胶颗粒在合适的溶剂
6、屮浸泡，充分吸液膨胀，然后转入层析柱内，加入欲分离的混合物后，再以同一溶剂洗脱。在洗脱过程中，大分了不能进入凝胶内部而沿凝胶颗粒之间的空袭最先流出柱外，而小分了可以进入凝胶颗粒内部的多孔网状结构，流速缓慢，以致嚴后流出柱外，从而使样品屮分子大小不同的物质按顺序分离开。目前使用的凝胶有簡聚糖凝胶、聚内•烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶及交联琼脂糖与葡聚糖共价结合的凝胶等。这些凝胶具有以下特点:化学性质稳定,不与待分离物质发生反应，没有或只有极少量的离子交换基团，有足够的机械强度。本实验使用窗聚糖凝胶。不同型号的葡聚糖凝胶用英文G表示,如G-25、
7、G-50、G-75、G-100等,后面的数字为凝胶吸水量乘以10。在实际工作屮，超细颗粒主要用于分辨率1-分高的柱层析屮，细颗粒用于制备，屮等和粗颗粒用于操作低压高流速的制备柱层析。根据凝胶层析的原理，对同一类型化合物的洗脱特征与组分的分子量有关，通过凝胶柱时，按分于大小顺序流出，分了量大考走在前瓯。通常以心•（或Kd）对分子量的对数作图可得一曲线，称“选择曲线”，曲线的斜率是凝胶性质的一个重要特征，在一定范囤内，曲线愈陡分级愈好。在测定分了量时，似使用曲线的直线部分为宜。分配系数Kd；（Ve—Vo）/ViVe,实际测得的洗脱体积。V
8、o外水体积，即存在于柱内凝胶颗粒外面空隙Z间的水相体积。Vi内水体积，即凝胶颗粒内部所含水相体积。如果某组分的分配系数Kd二0,即V。二V。，说明该组分完全不能进入凝胶颗粒微孔，洗脱时最先流出。（全排阻,如蓝葡聚糖200
