生化实验技术专题

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1、生化实验技术专题主要内容：介绍生物大分子分离纯化的一般步骤和原则；介绍层析技术、电泳技术、离心技术、超过滤技术的原理及其应用；总结蛋白质、核酸、酶、氨基酸测定的主要方法。目录第一节生物大分子物质的制备第二节几类主要的生化实验技术第三节蛋白质、核酸的检测第一节生物大分子物质的制备一．一般过程和原则二．注意事项三．纯化方案的设计和评价例：宇佐美曲霉537酸性蛋白酶的纯化确立有效成分的测定方法材料的选择和预处理细胞的破碎和细胞组分分离有效成分的抽提有效成分的纯化和浓缩生物大分子分离纯化的一般步骤和原则层析法电泳法超离心法透析和超滤盐析（

2、硫酸铵盐析）等点电沉淀有机溶剂沉淀离心│←前处理→│←粗分级→│←细分级→│材料选择与处理细胞破碎（机械破碎、溶账和自溶、酶解、化学处理）生物组织→→提取液→→粗产品→→结晶分子大小溶解度电荷性质吸附性质生物亲和力依据原理调整硫酸铵溶液饱和度计算表注意事项基本原则：防止生物分子变性、降解1．控制适当的pH2．控制低温3．注意提取过程中的溶液环境4．防止提纯过程中丟失一些辅助因子或亚基宇佐美曲霉537酸性蛋白酶的纯化纯化步骤总蛋白总活力比活力纯化倍数回收率（mg）（U）（U/mg蛋白）（%）1、粗酶液8043205411002、乙醇

3、沉淀2935851232.27833、醋酸钙沉淀2129801412.64694、盐析417714648.52415、丙酮沉淀11166110420.29276、结晶0.12130107219.703第二节几类重要的生化实验技术一、层析技术二、电泳技术三、离心技术四、透析和超过滤一．层析技术（chromatography）1．层析技术一般原理2．层析技术分类3．常用层析技术及应用层析技术原理层析技术是一种物理的分离方法。无论何种层析,都是由互不相溶的两个相组成:一是固定相(固体或吸附在固体上的液体），一是流动相（液体或气体）。层

4、析时，利用混合物中各组分理化性质（如吸附力、分子形状和大小、分子极性、分子亲和力、溶解度等）的差异，使各组分不同程度地分布在两相中，随着流动相从固定相上流过，不同组分以不同速度移动而最终被分离。混合物在层析系统中的分离决定于该混合物的组分在两相中的分配情况，一般用分配系数(distributioncoefficient,Kd）来描述。混合物各组分的分配系数差异越大，越容易分离开。物质在层析系统中的行为并不直接决定于其Kd，而取决于它的有效分配系数Keff:Keff=某一物质在A相中的总量某一物质在B相中的总量层析法分类（按装置

5、分类）纸层析薄膜层析柱层析洗脱液样品填充物分部收集玻璃柱氨基酸分析仪图解AspThrThrLysGlyGluSerProAlaCysValMetIleLeuTyrPheHisNH3Arg0.20.41.00.60.8光吸收流出液(mL)150cm柱，pH3.25，0.067mol/L柠檬酸钠150cm柱，pH4.25，0.067mol/L柠檬酸钠15cm柱，pH5.25，0.12mol/L柠檬酸钠缓冲液泵显色反应管茚三酮泵已分开的氨基酸离子交换柱样品注入口记录仪光电倍增管光源气液色谱图解（gas-liquidchromatigra

6、phy）层析柱恒温装置载气（流动相）样品）进样室检测器记录仪出口高效液相层析（HPLC）图解（highperformanceliquidchromatigraphy）层析柱恒温装置溶剂储瓶溶剂过滤器进样室检测器记录仪各类层析的原理和载体类别分离原理基质或载体吸附层析化学、物理吸附硅胶、氧化铝、羟基磷酸分配层析两溶剂相中的溶解效应纤维素、硅藻土、硅胶凝胶层析分子筛效应的排阻效应sepharose、sephadex离子交换层析离子基团的交换反应离子交换树脂、纤维素、葡聚糖亲和层析分离物与配体之间有带配基的sepharose特殊亲和力或

7、sephadex聚焦层析等电点和离子交换作用多缓冲交换剂（与带有多种电荷基团的配体相偶联的sepharose6B）几种主要沉淀方法比较常用层析技术及应用吸附层析分配层析凝胶过滤（分子筛层析）离子交换层析亲和层析聚焦层析吸附层析（absorptionchromatography）原理：载体：硅胶氧化铝羟基磷石灰应用：分离纯化蛋白质、酶、氨基酸、核苷酸等生化物质以吸附剂作为固定相，选择适当的溶剂作流动相。由于各种物质的极性不同，被吸附剂吸附的程度和在流动相中的溶解度不同。层析时，当流动相从固定相上流过时，各组分也就不同程度地被溶解（解

8、吸），然后又再被吸附、再溶解再吸附，从而以不同速度随流动相向前移动。分配层析（distribuptionchromatography）原理：载体：纤维素硅藻土硅胶应用：各种生化物质的分离鉴定分配层析实际上是一种连续抽提方式。如纸层析中滤纸的结合水为