DB22∕T 2912-2018 贝类中霍乱弧菌检测 微滴数字PCR法.pdf

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1、ICS67.120.30B50备案号：62757-2019DB22吉林省地方标准本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T2912—2018贝类中霍乱弧菌检测微滴数字PCR法DeterminationofVibriocholeraeinshellfish-dropletdigitalPCRmethod本标准仅供内部使用不得翻印2018-11-12发布2018-12-30实施吉林省市场监督管理厅发布本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T2912—2018本标准仅供内部使用不得翻印前言本标准按照G

2、B/T1.1-2009和GB/T20001.4-2015给出的规则起草。本标准由长春海关（原吉林出入境检验检疫局提出并归口）。本标准起草单位：长春海关（原吉林出入境检验检疫局验检疫技术中心）、延边海关综合服务技术中心（原延边出入境检验检疫局技术中心）。本标准主要起草人：罗雁非、孙佳、杜佳剑、聂丹丹、丁旭、王准、曲辉、彭勃。本标准仅供内部使用不得翻印I本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T2912—2018本标准仅供内部使用不得翻印贝类中霍乱弧菌检测微滴数字PCR法警示——使用本标准的人员应

3、有正规实验室工作的实践经验。本标准并未指出所有可能的安全问题。使用者有责任采取适当的安全和健康措施，并保证符合国家有关法规规定的条件。1范围本标准规定了贝类中霍乱弧菌检测微滴数字PCR法的试剂和材料、仪器和设备、样品、试验步骤和试验数据处理与防止污染措施。本标准适用于贝类中霍乱弧菌检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB4789.1-2016食品安全国家标准食品卫生微生物检

4、验总则GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法本标准仅供内部使用不得翻印GB19489实验室生物安全通用要求GB/T19495.3转基因产品检测核酸提取纯化方法SN/T1022进出口食品中霍乱弧菌检验方法SN/T2425-2010进出口食品中霍乱弧菌快速及鉴定监测方法实时荧光PCR方法WS/T230-2002临床诊断中聚合酶链反应（PCR）技术的应用3原理微滴式数字PCR平台通过产生微小油包水体系实现反应体系的分割，根据霍乱弧菌的溶血性特异性基因序列对贝类中霍乱弧菌进行鉴定。经PCR扩增后，根据泊松分布原理及阳

5、性微滴的个数与比例即可得出靶分子的起始拷贝数或浓度，实现对霍乱弧菌的快速定性检测。4试剂和材料除另有规定外，所有试剂均为分析纯。实验用水符合GB/T668中二级水的要求。4.1裂解液,成分包括：2%CTAB(cetyltrithylammoniumbromide，十六烷基三甲基溴化铵)，100mmol/LTris(trishydroxymethylaminomethane，三羟甲基氨基甲烷)，1.4mol/LNaCl，20mmol/LEDTA(ethylenediaminetetraaceticacid，乙二胺四乙

6、酸)，用HCl调至pH8.0。4.2酚/氯仿/异戊醇（25:24:1，v/v/v）。4.3氯仿。4.4异戊醇。4.5无水乙醇。1DB22/T2912—20184.6异丙醇。4.770%乙醇。4.82×ddPCR预混液。本标准仅供内部使用不得翻印4.9霍乱弧菌旋转酶（gyrase）基因引物和探针4.10上游引物：5’-GCCAAAATTGTGCGTATCAG-3’下游引物：5’-ATAATCTTGGGCAATCGCA-3’探针：5’-（FAM）-AACTGGCTTCCAAACTGACGATAACC-（TAMRA）-3

7、’4.11菌株：霍乱弧菌阳性标准菌株。5仪器和设备5.1微量移液器：0.1μL～2.5μL，1μL～10μL，2μL～20μL，10μL～100μL，20μL～200μL，100μL～1000μL。5.2高速冷冻离心机(12000r/min)。5.3涡旋混合器。5.4核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。5.5微滴生成仪。5.6PCR仪。5.7微滴读数系统。本标准仅供内部使用不得翻印6样品6.1样品的采集按照GB4789.1-2016中3.1的规定实施。6.2样品前处理按照SN/T1022的规定执行。7试验步骤7.1增菌

8、培养按照SN/T1022的规定执行。7.2样品DNA提取7.2.1用移液器（5.1）吸取霍乱弧菌增菌液1mL，加到1.5mL无菌离心管中，12000r/min离心（5.2）10min，吸弃上清；加入50μLDNA裂解液（4.1），混匀（5.3）后沸水浴5min，12000r/min离心5min。取上清保存于-20℃备用。7.2.2按照GB/T19495.3的