传代细胞与观察.doc

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1、传代细胞与观察浙江省第三届大学生生命科学学科竞赛实验记录序号：实验时间:7月10口9：30一14：00请勿透露学校、教师和个人信息实验内容：细胞传代与观察天气：气温：一、实验目的：了解传代细胞的传代方法及其操作过程，学习观察体外培养细胞的形态及生长状况。二、实验原理：细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，就必须进行传代（再培养）。传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。三、实验试剂与器材及材料：（-）

2、实验试剂：DMEM培养基，小牛血清，0.25%胰蛋白酶，PBS缓冲液。以上溶液均需分装，包扎好，灭菌后备用。（二）实验仪器和材料：CO2培养箱，倒置显微镜，超净台；培养瓶，弯头吸管，废液缸，离心管；75%酒精棉球，酒精灯，培养细胞四、实验步骤：在做传代细胞培养之前，首先将培养瓶置于显微镜下，观察培养瓶中细胞是否已长成致密单层，如已长成单层，即可进行细胞的传代培养。其步骤如下：1.入无菌室之前用肥皂洗手，用75%酒精擦拭消毒双手。2.倒置显微镜下观察细胞形态，确定细胞是否需要传代及细胞需要稀释的倍数。将实验所需培养基置37°C下预热。3.手在进入

3、超净台前应消毒；超净台台面应整洁，用75%酒精溶液擦净。4.打开超净台的紫外灯照射台面30min左右，打开抽风机，关闭超净台的紫外灯，清洁空气，除去臭氧。5•点燃酒精灯；所有东西在进入超净台前需用75%酒精消毒。6.将培养基瓶口用75%酒精消毒，过酒精灯火焰后斜置于酒精灯旁的架子上。7.倒掉培养细胞的旧培养基。用适量的PBS液清洗培养瓶，以除去残留的旧培养基。&每个大培养瓶加入ImL胰酶，小瓶用量酌减，使瓶底细胞都浸入到酶溶液中。肉眼观察，当见到瓶底有细胞滑落，酶溶液变浑浊时终止消化。一般室温消化时间约为l-3mino9.加入少量的含血清的新鲜

4、培养基终止反应，反复吹打消化好的细胞使其脱壁并分散，用弯头滴管转移至离心管中，1000r/s离心5min后弃上清液。加入2ml的新鲜培养基，吹打均匀后分装到新培养瓶中，加适量的培养基。盖上瓶盖，适度拧紧后再稍回转，以利于C02气体的进入，将培养瓶放回C02培养箱。9.对悬浮培养细胞，步骤7-9不做。可将细胞悬液进行离心去除旧培养基上清，加入新鲜培养基，然后分装到各瓶屮。10.观察(1)观察体外培养细胞的儿个问题：细胞培养24h后，即可进行观察，观察的重点如下：A.首先要观察培养细胞是否污染。主要观察培养液颜色的变化及混浊度。浙江省第三届大学生生

5、命科学学科竞赛实验记录序号：实验时间:7月10口9：30—14：00请勿透露学校、教师和个人信息B.观察培养液颜色变化及细胞是否生长。C.如细胞已生长，则要观察细胞的形态特征并判断其所处的生长阶段。观察时，可参照以下(2)的描述进行。D.观察完毕，可用台盘蓝染液对细胞进行染色。以确定死、活细胞的比例。(2)细胞的生长阶段及其形态特征传代培养的细胞需逐口进行观察，注意细胞有无污染，培养液颜色的变化及细胞生长的情况。一般单层培养的细胞，从培养开始，经过生长、繁殖、衰老及死亡的全过程。它是一个连续的生长过程，但为了观察及描述，人为地将其分为5个时期，

6、但各期间无明显绝对界限。现分别描述如下：A・游离期：当细胞经消化分散成单个细胞后，由于细胞原生质的收缩和表面张力以及细胞膜的弹性。所以，此时细胞多为圆形，折光率高,此期可延续数小时。B.吸咐期（贴壁）：由于细胞的附壁特性，细胞悬液静置培养一段时间（约7~8h）后，便附着在瓶壁上（此期不同细胞所需吋间不同）。在显微镜下观察时可见瓶壁上有各种形态的细胞，如圆形、扁形、短菱形。细胞的特点，大多立体感强，细胞内颗粒少，透明。C.繁殖期：培养12h以后直到72h（不同细胞亦不同），细胞进入繁殖期，加速了细胞生长和分裂。此期包括由几个细胞形成的细胞岛（即由

7、少数细胞紧密聚集而呈现的孤立细胞群，常散在地分布瓶壁上），到细胞铺满整个瓶壁（即所谓形成细胞单层）的过程。此期细胞形态为多角形（呈现上皮样细胞的特征）。细胞特点：透明，颗粒较少，细胞间界限清楚，并可隐约见到细胞核。根据细胞所占瓶壁冇效面积的百分率，又可将其生长状况分为四级。以”的多少表示如下：+：细胞占瓶壁冇效面积（也就是细胞能生长的瓶壁面积）的25%以内冇新生细胞。一般耍观察3〜5个视野内的细胞生长状况，然后加以综合分析判断。++：细胞占瓶壁有效面积的25〜75%以内具新生细胞。+++：细胞占瓶壁有效面积的75〜95%具新生细胞.细胞排列致密

8、。但仍冇空隙。++++：细胞占瓶壁95%以上，细胞已长满或接近长满单层，细胞致密,透明度好。从++到++卄为细胞的对数增长期（或称为指数增长期）。B.