提高树突状细胞腺病毒感染效率的融合蛋白的表达及活性鉴定.pdf

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1、476细胞与分子免疫学杂志(ChinJCellMolImmuno1)2014，30(5·论著·文章编号：1007—8738(2014)05—0476—04提高树突状细胞腺病毒感染效率的融合蛋白的表达及活性鉴定田仁礼一，殷小涛一，王伟一，林晓亮，朱晓明，徐元基，阎瑾琦。，张巍，高江平，于继云(解放军总医院泌尿外科，北京100853；军事医学科学院基础医学研究所，北京100850)【摘要】目的构建表达靶向树突状细胞融合蛋白CT40L的原核表达载体，在大肠杆菌中表达，并对CT40L融合蛋白进行纯化鉴定及功能验证。方法

2、从GenBank上查找柯萨奇病毒和腺病毒受体(CAR)、1"4噬菌体fibritin和小鼠CIMOL的基因序列，并将其主要功能区域连接形成拼接序列；序列进行原核表达密码子优化后将其克隆至原核表达载体pET42a(+)，构建重组表达载体pET42a-CT40L，并将该载体转化大肠杆菌BL21(DE3)，经IPTG诱导表达CT40L／GST融合蛋白，并采用GST琼脂糖凝胶纯化重组蛋白。纯化后的重组蛋白经Westernblot法、间接ELISA鉴定其免疫活性。结果重组表达载体经NcoI和EcoRI酶切鉴定正确；IPT

3、G诱导后经SDS-PAGE分析表明获得了相对分子质量()78000大小的重组蛋白；纯化后的蛋白纯度达到90％。Westernblot法和ELISA检测证实纯化的CT40L分子能够与特异性抗体及相应受体发生反应，表明该融合蛋白具有良好的免疫学活性。结论成功构建了原核表达载体pET42a-CT40L，利用大肠杆菌表达系统实现了融合分子的可溶性表达，纯化后CT40L融合蛋白经检测具备较高的免疫学活性。[关键词】CD40L；靶向治疗；原核表达；腺病毒感染效率[中图分类号]R392．11，R392—33，R446．61[

4、文献标志码]AExpressionandactivityidentificationofafusionproteinforpromotingadenovirusinfectioneficiencyofdendriticcellsTIANRenli一，YINXiaotao一，WANGWei一，LINXiaoliang一，ZHUXiaoming，XUYuanji，YANJinqi，ZHANGWei，GAOJiangping，YUJiyunDepartmentofUrology，GeneralHospitalofPL

5、A，Beijing100853；InstituteofBasicMedicalSciences，AcademyofMilitaryMedicalSciences，Beijing100850，ChinalAbstract]ObjectiveToconstructaprokaryoticexpressionplasmidforCT40L，expressthetargetproteininEco#，purifytheCT40Lfusionproteinandverifyitsantigenicity．MethodsG

6、enesequencesofCoxsackieandadenovirusrecE}ptor(CAR)．bacteriophage34fibritinandmouseCD40LwerefoundoutinGenBank．ThenfunctionaldomainsofthreemoleculeswereIinkedtoformafusionsequencewhichwasthenoptimizedforprokaryoticexpression．Theoptimizedsequencewasclonedintopr

7、okaryoticexpressionvectorpET42a(+)toconstructtherecombinantexpressionvectorpET42a-C1-4OL．TherecombinantvectorwastransformedintoB1_21(DE3)andthefusionproteinCT4OL／GSTwasinducedbyIPTG．ThefusionproteinwasthensubjectedtopurificationusingGSTa仟initychromatographya

8、ndtoidentificationoftheimmuneactivityusingWesternblofingandELISA．ResultsTherecombinantexpressionvectorwasverifiedcorrectbydoubledigestionwithNcoIandEcoRI．AfterIPTGinduction。SDS-PAGEshowedthatthe