基于核酸切割酶与脱氧核酶的荧光循环放大系统检测铅（Ⅱ）.pdf

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1、第4O卷分析化学(FENXIHUAXUE)研究报告第8期2012年8月ChineseJournalofAnalyticalChemistry1236～1240基于核酸切割酶与脱氧核酶的荧光循环放大系统检测铅(Ⅱ)赵永席齐林杨卫军魏帅王亚玲(西安交通大学生命科学与技术学院生物医学信息工程教育部重点实验室，西安710049)(中国烟草总公司陕西省公司陕西烟草质量监督检测站，西安710061)摘要利用核酸切割酶(Nickingendonuclease)识别特定DNA双链并切割其中某条单链的性质，构建了基于8-17E脱氧核酶(8-17EDNAzyme)的Pb荧光循环放大检

2、测方法。Pb可激活8-17E脱氧核酶水解RNA底物，产生并释放出的单链与分子信标探针(Molecularbeacon，MB)杂交，导致其茎环结构被破坏，荧光信号恢复；同时形成含有核酸切割酶Nt．BbvCI识别位点的双链区域。在核酸切割酶Nt．BbvCI的作用下，分子信标探针被切割释放，游离出来的单链可与其它分子信标重新杂交，从而触发下一轮酶切，引起荧光检测信号的循环放大。本方法避免了8-17E脱氧核酶与底物链的修饰，最低可以检测出水溶液中1．0×lf-omol／LPb”，并在2倍浓度的zn2，以及5倍浓度的其它干扰金属离子存在的情况下对Pb显示出良好的选择性。本方

3、法对环境水样中pb2的标准加样回收率为96．1％～108．O％。关键词铅(Ⅱ)；脱氧核酶；核酸切割酶；荧光循环放大检测1引言随着城市规模的不断扩大和工业生产的急速发展，大量生活污水和工业废水排人环境，对环境造成严重污染。Pb作为环境中广泛存在的重金属污染物，毒性大，累积性强，微量Pb即可对人体各个系统和器官的功能产生严重影响】。因此，建立一种简便、高灵敏度、高选择性、可用于水、食物、空气、土壤、烟草制品等实际样品中Pb。。检测方法，从而有效控制其对环境的污染，已成为当前各国政府关注的焦点和科研工作者研究的热点。传统的Pb。‘检测方法有原子吸收／发射光谱法、色谱法】

4、、电感耦合等离子体质谱法】，然而，这些方法往往存在依赖较大型的仪器设备、检测成本较高、样品预处理过程繁琐耗时、需要专业的操作人员等缺点，在一定程度上限制了它们在Pb检测中的实际应用。脱氧核酶(DNAzyme)是一类具有酶活性的功能核酸】，可通过体外筛选技术(Systematicevolutionofligandsbyexponentialenrichment)得到，其活性与某些金属离子密切相关。相对于蛋白酶，脱氧核酶不仅具有很高的催化活性，而且具有稳定性好、易于合成和修饰、价格便宜、对环境影响小等优点。其中8—17E脱氧核酶在Pb存在的情况下可以水解RNA底物磷酸

5、二酯键”。基于此，许多新型Pb。。的传感检测方法，诸如荧光法叫、比色法、电化学法等得到了快速发展。然而，这些方法大部分需要对8—17E脱氧核酶或底物链进行标记或修饰，增加了检测成本与操作复杂程度；此外，环境样品中的复杂成分容易引起较高的背景信号，影响Pb。‘检测的灵敏度。将现有体系相对简单的等温信号放大技术和上述体系相结合，建立简便、高灵敏度的Pb检测新方法无疑成为一种最佳的选择。目前，核酸切割酶介导的恒温信号放大技术已被广泛应用于DNA检测l。核酸切割酶可以识别目标DNA与探针杂交区域中的特定双链序列，切割探针产生检测信号，而游离出的目标DNA又可以与下一个探针

6、杂交，最终通过核酸切割酶的循环切割放大检测信号。与传统的核酸扩增技术相比，该方法更加简便、快捷，且反应体系简单，并避免了核酸扩增技术中的非特异性扩增困扰。为了将核酸切割酶引入Pb的检测，并实现8—17E脱氧核酶与底物链的无标记，本研究在底物链与分子信标探针上分别设计了核酸切割酶Nt．BbvCI的识别序列。当溶液中存在Pb时，被8—17E脱氧核酶切割的底物链与分子信标探针杂交，打开分子信标的同时形成Nt．BbvCI作用位点，从而在核酸切割酶Nt．BbvCI循环切割分2012-04-04收稿；2012-06-03接受本文系中国烟草总公司陕西省公司研究基金项目资助E-m

7、ail：yxzhao@mail．xjtu．edu．cn第8期赵永席等：基于核酸切割酶与脱氧核酶的荧光循环放大系统检测铅(Ⅱ)子信标探针的作用下实现荧光检测信号的放大，Pb检测的灵敏度明显提高。2实验部分2．1仪器与试剂FluoroMax-4型荧光光度计(法国HoribaJobinYvon公司)，激发波长为495am，发射光谱波长扫描范围为505～580am，狭缝宽为5nm。HH一2型数显恒温水浴锅(江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司)，SX-500型自动高压灭菌锅(日本TomyDigitalBiology公司)。8-17E脱氧核酶(5r_CATCTCTTCTCCGA

8、GCCGG