《基于滚环扩增和核酸外切酶ⅲ辅助循环放大的高灵敏荧光生物传感器研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
３２学校代号：１０５１３１１１００２１学号：Ｓ密级：不保密湖南大学硕±学位论文基于滚环扩增和核酸外切酶ＩＩＩ辅助循环放大的高更敏焚光生物传感器研究：刘陈力为学位申巧人姓名导师姓名及职称：楚霞教授：化学化工学院培养单位：分析化学专业名称论文提交日期２０１６年５月：２０１６年５月论文答辩日期：俞汝勤教授答辩委员会主席 湖南大学学位论文原创性声明立进行研究所取本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独引用的内容外，本论文不包含任何其得的研究成果。除了文中将别加标注他个人或集体己经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献的个中明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果人和集体，均己在文由本人承担。作者签名；力巧曰期；年／月曰蘇备＾学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部口或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查入有关阅和借阅。本人授权湖南大学可Ｗ将本学位论文的全部或部分内容编、数据库进行检索，可Ｗ采用影印缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。本学位论文属于。１、保密□，在年解密后适用本授权书２、不保密ｄ。＂＂（请在Ｗ上相应方框内打Ｖ）作者签名；巧－力＾日期；年／月＾日导师签名：曰期：刀／＆年Ａ月曰＾Ｉ ＳｔｕｄｉｅｓｏｆＵｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔＢｉｏｓｅｎｓｏｒＢａｓｅｄｏｎＲｏｌｌｉｎｇＣｉｒｃｌｅｌｉｃａｏｎａｎｄｘｏｎｕｃｌｅａｓｅＩＩＩ－Ｒｅｃｃｌｉｎ乂ｍｐｆｉｔｉＥＡｉｄｅｄｙｇｂｙＬＩＵＣｈｅｎｌｉｗｅｉＢ．ａｎｓｈ．Ｓ（ＨｕｎＣｋｙＵｎｉｖｅｒ）２０１２ｙＡｔｈｅｓｉｓｓｕｂｍｉＵｅｄｉｎａｉｌｉａｌｓａｔｉｓｆａｃｔｉｏｎｏｆｔｈｅｐ民ｅｑ山ｒｅｍｅｎｔｓｆｏｒ化ｅｄｅｇｒｅｅｏｆＭａｓｔｅｒｏｆＳｃｉｅｎｃｅｎｉＡｎａｌｙｔｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙｉｎｔｈｅＧｒａｄｕａｔｅＳｃｈｏｏｌｏｆＨｕｎａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＳｕｐｅｒｖｉｓｏｒＰｒｏｆｅ巧ｏｒＣＨＵＸｉａＭａｙ，２０１６ 硕±学位论文摘要滚环扩増一（ＲＣＡ）作为种等温放大过程，有着极强的核酸扩増能力，不仅一可直接对特定的ＤＮＡ分子进行扩增，还能将飽核酸的信号进行放大，得到条由环形ＤＮＡ模板互补序列串联组成的长单链ＤＮＡ，。通过设计环形ＤＮＡ模板的序列可赋予ＲＣＡ产物药物负载、範标识别、巧光成像等功能。核酸外切酶ＩＩＩ因其高效’的催化水解能力Ｗ及对３端平齐或凹陷的双链ＤＮＡ特异的识别能力被广泛应用到信号放大战略中。本研究论文将滚环扩增技术和核酸外切酶ＩＩＩ辅助循环放大技术一与生物传感方法相结合，构建了种多重信号放大的巧光生物传感平台，实现对核酸酶、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、小分子物质和离子的检测。（１）第二章，基于滚环扩增（民ＣＡ）和核酸外切酶ＩＩＩ（ＥｘｏＩＩＩ）辅助循环放大一个稳健的传感平台用于Ｓ１核酸酶的高灵敏检测。将Ｓ１核酸酶的底，构建了物ＤＮＡ链（ｓＤＮＡ）设计成引发ＲＣＡ的引物ＤＮＡ链，得到的ＲＣＡ产物与大量’ＴａｑＭａｎ探针互补杂交形成ＴａｑＭａｎ探针３端凹陷的双链结构，在ＥｘｏＩＩＩ的存在’，。下，ＴａｑＭａｎ探针从３端开始被水解其上的炎光基团被释放产生巧光信号与此’Ｍ同时，３端凸出的ＲＣＡ产物则免遭酶切继续与其它Ｔａｑａｎ探针杂交，循环往复，产生显著增强的英光信号。当体系中存在Ｓ１核酸酶时，ｓＤＮＡ被水解成单个或小片段的脱氧核糖核巧酸，此时缺乏引物ＤＮＡ链，致使民ＣＡ反应和后续的Ｅｘｏｍ辅助循环放大反应无法进巧，从而检测不到英光信号，且英光强度随ＳＩ核酸酶浓度的增加而降低。由于进巧了双重信号放大，该方法展示了极其优异的灵敏性，７ｉ对３１核酸酶的检测下限达到了５．０Ｘ１（ＴＵｉｌ／。该传感器用于实际样品分析中ｆ也有令人满意的结果。一（２）第Ｈ章，建立了种利用滚环扩増（ＲＣＡ）连接两次核酸外切酶ＩＩＩ（Ｅｘｏ－－ＩＩＩ）辅助循环放大（ＥｘｏｍＲＣＡＥｘｏＩＩＩ）的巧光传感平台用于超灵敏地检测ｍｉｃｒｏ’Ａ一ＲＮＡ。设计的３端凸出的发夹ＤＮ集识别禪标和信号转导多种功能于体，发夹ＤＮＡ和目标ｍｉｃｒｏＲＮＡ互补杂交后形成双链部分的序列将被ＥｘｏＩＩＩ水解移除，从而释放出可继续打开其它发夹ＤＮＡ的目标ｍｉｃｒｏＲＮＡ和引发ＲＣＡ反应的引物ＤＮＡ链。该引物链可与ＲＣＡ中的环形ＤＮＡ模板杂交并延伸得到ＲＣＡ产物，ＲＣＡ产物上包含成千上万个可与ＴａｑＭａｎ探针互补杂交的序列，杂交后形成ＴａｑＭａｎ探’’Ｍ针的３端凹陷、ＲＣＡ产物３端凸出的单双链串联结构，在ＥｘｏＩＩＩ的存在下，Ｔａｑａｎ探针被水解，，巧光基团脱离浑灭基团产生巧光信号。该方法的动态响应范围达到屯个数量级，且检测限达到了０２ａＭ。．３（３）第四章，基于滚环扩増（民ＣＡ）和核酸外切酶ＩＩＩ（Ｅｘｏ山）辅助循环的ＩＩ 基于滚环扩増和核酸外切酶阻辅助循环放大的高灵敏巧光生物传感器研巧双重放大巧光传感平台一，利用些物质（ＡＴＰ、钟离子）对Ｓ１核酸酶活性的抑制＋作用实现了对ＡＴＰ和Ｋ的检测。Ｓ１核酸酶是单链特异性核酸内切酶，因体系中－ＤＮＡ存在Ｓ１核酸酶，单链的ＲＣＡ引物链（ｔ）被水解成单个或小片段的核巧酸，因此无法引发ＲＣＡ反应，，后续的ＥｘｏＩＩＩ酶切反应也无法进行致使巧光信号难＋－ＤＮＡ因ＳＷ被检测。当反应体系中存在ＡＴＰ或Ｋ时，ｔ１核酸酶的水解活性被抑制而免遭水解，ＲＣＡ反应和ＥｘｏＩＩＩ辅助的萊光信号放大反应顺利进斤，英光大大＋５－２００ｎＭ和０－增强。ＡＴＰ和Ｋ的线性响应范围分别为．５５ｍＭ，检测下限分别为０ｎＭ和２ｎＭ。此外还可用于核酸酶抑制剂的筛选。．５，该方法关键词：巧光生物传感器；巧环扩増；巧巧外切巧ＩＩＩ；Ｓ１孩巧巧；ＭｉｃｒｏＲＮＡ；Ｈ巧巧巧巧１Ｈ 硕ｄｔ学位论文Ａｂｓｔｒａｃｔ民ｏｉｌｉｎｇｃｉｒｃｌｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（民ＣＡ）ｉｓａｎｉｓｏｔｈｅｒｍａｌＤＮＡａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏ打ｐｒｏｃｅｓｓｗｉｔｈｅｘｃｅｌｌｅ打ｔｃａｐａｂｉｌｉｔｙｏｆｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄａｍｐｌｉ打ｃａｔｉｏｎ．ＩｔｃａｎｃｏｎｖｅｒｔａｓｈｏｒｔＤＮＡｒ－ｐｉｍｅｒｉｎｔｏａｌｏｎｓｉ打ｌｅｓｔｒａｎｄｅｄＤＮＡＣＯ打ｔａｉ打ｉｎａｌａｒｇｅａｍｏｕｎｔｏｆｔａｎｄｅｍｒｅｅａｔｓｇｇｇｐｔｈａｔｗｅｒｅｔｈｅｈｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎｓｅｕｅ打ｃｅｏｆｃｉｒｃｌｅＤＮＡｔｅｍｌａｔｅ．Ｔｈｅ民ＣＡｒｏｄｕｃｔｓｃａｎｙｑｐｐｂｅａｓｓｉｎｅｄｄｆｅｒｅｎｔｆｕｎｃｔｉｏｎｓｌｉｋｅｄｒｕｌｏａｄｉｎｔａｒｅｔｒｅｃｏｎｉｔｉｏ打ａ打ｄｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｇｉｆｇｇ，ｇｇｉｍａｇｉｎｇｂｙｄｅｓｉｇｎｅｄｔｈｅｓｅｑｕｅ打ｃｅｏｆｃｉｒｃｌｅＤＮＡ化ｍｐｌａｔｅ．Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ，民ＣＡｈａｖｅｂｅｅ打ｔｈｅｓｕｂｅｃｔｏｆｉｎｔｅｎｓｅｒｅｓｅａｒｃｈｉ打ｔｈｅａｓｔｄｅｃａｄｅｓｗｉｔｈｉｔｓｒｏｅｒｔｉｅｓｉｎｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｊｐｐｐｂｉｏｌｏａ打ｄｃｌｉｎｉｃａｌｍｅｄｉｃｉ打ｅ．ＥｘｏｎｕｄｅａｓｅＩＩＩＥｘｏＩＩＩａｌｓｏｈａｓｂｅｅｎｗｉｄｅｌａｌｉｅｄｇｙ（）ｙｐｐ化ｔｈｅｓｉｇｎａｌａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏ打ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓｂｅｃａｕｓｅｏｆｉｔｓｓｐｅｃｉｆｉｃｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎｔ；ｏｔｈｅ＞ｄｏｕｂ－ｌｅｓｔｒａｎｄｅｄＤＮＡｗｉｔｈａｂｒｅａｓｔｏｒｒｅｃｅｓｓｅｄ３ｅｎｄ．Ｉｎｔｈｉｓａｐｅｒｗｅｔａｋｅｐ，ａｄｖａｎｔａｇｅｓｏｆ民ＣＡａｎｄＥｘｏＩＩＩｔｏｃｏｎｓｔｒｕｃｔａｍｕｌｔｉｐｌｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏ打ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｂｉｏｓｅ打ｓｏｒｓｆｏｒｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｎｕｃｌｅａｓｅｍｉｃｒｏＲＮＡａｎｄｓｍａｌｌｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．，１Ｉ打ｃｈａｐｔｅｒ２ａｒｏｂｕｓｔ幻ｕｏｒｅｓｃｅｎｔｓｅｎｓｉｎｌａｔｆｏｒｍｆｏｒｕｌｔｒａｓｅ打ｓｉｔｉｖｅａｓｓａｏｆ（），ｇｐｙｎｕｃｌｅａｓｅｈａｓｂｅｅｎｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄｂａｓｅｄｏｎｒｏｌｌｉｎｃｉｒｃｌｅａｍｌｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅｇｐｉｎ－ａＩｉｄｅｄｒｅｃｙｃｌｉｎｇａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ．ＴｈｅｓｕｂｓｔｒａｔｅＤＮＡ（ｓＤＮＡ）ｏｆＳｎｕｃｌｅａｓｅｗａｓｄｅｓｉｇｎｅｄａｓｔｈｅｐｒｉｍｅｒｔｏｇｅｎｅｒａｔｅ民ＣＡｐｒｏｄｕｃｔｓｔｈａｔｃａｎｈｙｂｒｉｄｉｚｅｗｉｔｈｔｈｅ＾ｒｅ－ｕｅｎｃｈｅｄＭａｎ－ＡｐｑＴａｑｐｒｏｂｅｓａｎｄｆｏｒｍｒｅｃｅｓｓｅｄ３ｔｅｒｍｉｎｕｓｄｏｕｂｌｅｓｔｒａｎｄｅｄＤＮｓ．Ｉｎｔｈｅｐｒｅｓｅ打ｃｅｏｆｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅＩＩＩ（ＥｘｏＩＩＩ），ｔｈｅＴａｑＭａｎｐｒｏｂｅｓｗｅｒｅｄｉｇｅｓ１：ｅｄｆｒｏｍｔｈｅ，３－ｈｄｒｏｘｅｒｅｎｅｅ打ｈａｎｃｅｄｙｈｉｎｉｎｉｒｅｌｅａｓｉ打ｔｈｅ打ｕｏｒｏｈｏｒｅａｎｄｒａｔｉｎ打ｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｙ，ｇｐｇｇ＞ｓｉｎａｌｓ．ＭｅａｎｗｈｉｌｅｔｈｅＲＣＡｒｏｄｕｃｔｓｗｉｔｈ３ｒｏｔｒｕｄｉｎｅｎｄｓｗｅｒｅｌｉｂｅｒａｔ：ｅｄａｎｄｇ，ｐｐｇｈｂ＇ｉｉｄｉｚｅｄｗｉｔｈｏｔｈｅｒＴａＭａｎｒｏｂｅｓｔｒｉｅｒｉｎａｎｏｔｈｅｒｃｃｌｅｓａｎｄｏｂｔａｉｎｉｎｙｑｐ，ｇｇｇｙｇｒｅｍａｒｋａｂｌｅｌｙｉｎｃｒｅａｓｉｎ打ｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ．ＨｏｗｅｖｅｒｉｎｔｈｅｒｅｓｅｎｃｅｏｆＳＩｎｕｃｌｅａｓｅｓＤＮＡｇ，ｐ，－－ｗｈｗａｓｃｅａｖｅｄｎｏｍｏ打ｏｏｒｓｈｏｒｏｌｉｏ打ｕｃｅｏｄｅｓｉｅｃｅｓｉｌｄ打ｏｃａｕｓｅｈｅｌｉｔｔｇｌｔｉｐｃｈｃｏｕｔｔ，民ＣＡ－ｒｅａｃｔｉｏ打ａｎｄｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔＥｘｏｉｎａｉｄｅｄｒｅｃｙｃｌｉｎｇａｍｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｒｅａｃｔｉｏｎ，ｒｅｓｕｌｔｉｎｐｇｎｅｘｒｅｍｅｕｏ＊ｗｅａｋｆｉｅｓｃｅｎｃｅｅｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｉ打化ｎｓｔｒａｄｕａｒｅｃｅｄｗｉｈｉｔｌｙｌ．ＴｈｉｙｇｌｌｙｄｕｔｉｎｃｒｅａｓｉｎｇｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆＳＩｎｕｃｌｅａｓｅ．Ｄｕｅｔｏｔｈｅｄｏｕｂｌｅｓｉｎａｌａｍｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｔｈｅｇｐ，ｄｅｖｅｌｏｐｅｄｍｅｔｈｏｄｗａｓｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄ化ｅｘｈｉｂｉｔｅｘｃｅｅｄｉｎｇｌｙｅｘｃｅｌｌｅｎｔｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｗｉｔｈａ－７ｄｅＸ＊ｔｅｃｔｉｏｎｌｉｍｉｔｏｆ５ｌ〇ｕＭｏｉｅｏｖｅｒｔｈｅｎｓｉｎｓｓｋｍｗａｓｕｓｅｄｆｏｒｔｈｅｒｅａｌ，ｓｅｇｙｓａｍｌｅａｎａｌｓｗｉｔｈｓａｔｉｓｆｉｅｄｒｅｓｕｌｔｓｐｙｉｓ．（２）Ｉｎｃｈａｐｔｅｒ３，ａｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｓｅｎｓｏｒｂａｓｅｄｏｎｒｏｌｌｉｎｇｃｉｒｃｌｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ－－ＲＣＡ－ｂｒｉｄｅｄｔｗｏｓｔａｅｅｘｏ打ｕｃｌｅａｓｅＩＩＩＥｘｏＩＩＩａｉｄｅｄｒｅｃｃｌｉｎａｍｌｉｆｉｃａｔｉｏ打Ｅｘｏ（）ｇｇ（）ｙｇｐ（ＩＶ 基于滚环扩増和核酸外切酶阻辅助循环放大的高灵敏焚光生物传感器研究ｉｎ－民ＣＡ－ＥｘｏＩＩＩｅｄｆｏｒｈｗａｓｄｅｖｅｌｏｉｈｌｓｅｎｓｉｔｉｖｅｄｅｌｅｔｉｏｎｏｆｍｉｃｒｏＲＮＡ．Ｔｈｅ）ｐｇｙａｎａｌｙｓｉｓｏｆＤＮＡｉｓａｃｃｏｍｌｉｓｈｅｄｂｙｒｅｃｏｇｎｉｚｉｎｇｔｈｅｔａｒｇｅｔｔｏａｈａｉｉｉ打ＤＮＡ化ａｔｐｐ化－ｉｎｒａｔｅｓｔａｒｅｔｂｉｎｄｉｎａｎｄｓｉｎａｌｔｒａｎｓｄｕｃｅｒｗｉｔｈｉ打ｏｎｅｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｄｅｓｉｎｇｇｇｇｇ，－ｆｏｌｌｏｗｅｄｂｙｔｈｅｔａｒｅｔｂｉ打ｄｉ打ｏｆｈａｉｒｉ打ｉ打ｄｕｌｅｘＤＮＡｒｅｍｏｖｅｄｓｔｅｗｉｓｅｂｇｇｐｐｐｙＥｘｏＩＩＩａｃｃｏｍｐａ打ｉｅｄｂｔｈｅｒｅｌｅａｓｉｎｏｆｔａｒｅｔＤＮＡｆｏｒｔｈｅｓｕｃｃｅｓｓｉｖｅｈｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎｙｇｇｙａ凸ｄｃｌｅａｖａｇｅｐｒｏｃｅｓｓａｎｄａｕｔｏ打ｏｍｏｕｓｇｅ打ｅｒａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｐｒｉｍｅｒｔｈａｔｉ打ｉｔｉａ１：ｅ民ＣＡｒｅａｃｔｉｏ打ｗｉｔｈａｃｉｒｃｌｅＤＮＡｔｅｍｐｌａｔｅ．Ｔｈｅ民ＣＡｐｒｏｄｕｃｔｓｃｏｎｔａｉｎｉ打ｇｔｈｏｕｓａｎｄｓｏｆｒｅｐｅａｔｅｄｓｅｑｕｅ打ｃｅｓｔｈａｔｈｙｂｒｉｄｉｚｅｗｉｔｈＴａｑＭａｎｐｒｏｂｅａｎｄｔｈｅ打ｄｅ化ｃｔｅｄｂｙＥｘｏ－Ａｆｉｎａｓｓｉｓｔｅｄｒｅｃｙｃｌｉｎｇａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｔｅｒｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，ｔｈｅＴａｑＭａｎｐｒｏｂｅｓａｒｅ’ｄｉｅｓｔｅｄｆｒｏｍｔｈｅｒｅｃｅｓｓｅｄ３ｈｄｒｏｘｙｌｔｅｒｍｉｎｉｂｙＥｘｏＩＩＩｒｅｌｅａｓｉ打ｔｈｅｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅｓｇｙ，ｇ＞ａｎｄｅｎｅｒａｔｉｎｅｎｈａｎｃｅｄｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｓｉｎａｌｓ．ＭｅａｎｗｈｉｌｅｔｈｅＲＣＡｒｏｄｕｃｔｓｗｉｔｈ３ｇｇｇ，ｐｐｒｏｔｒｕｄｉｎｅｎｄｓａｒｅ１化ｅｒａｔｅｄａｎｄｈｙｂｒｉｄｉｚｅｗｉｔｈａｎｏｔｈｅｒＴａＭａｎｒｏｂｅｓｔｒｉｅｒｉｎｇｑｐ，ｇｇｇａｎｏｔｈｅｒｃｙｃｌｅｓａｎｄｏｂｔａｉｎｉｎｓｉｇ打ｉ行ｃａｎｔｌｉ打ｃｒｅａｓｉ打ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ．Ｔｈｅｒｏｏｓｅｄｇｙｇｐｐｓｔｒａｔｅｇｙｓｈｏｗｅｄａｗｉｄｅｄｙｎａｍｉｃｒａｎｅｏｖｅｒ７ｏｒｄｅｒｓｏｆｍａｎｉＵｉｄｅｗｉｔｈａｌｏｗｌｉｍｉｔｏｆｇｇｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆ０．３２ａＭ．（３）Ｉ打ｃｈａｐ化ｒ４，ｏ打ｔｈｅｂａｓｉｓｏｆａｄｕａ＾ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏ打ｆｌｕｏｒｅｓｃｅ打ｔｓｅｎｓｉｎｇｐｌａｔｆｏｒｍｃｏｍｏｓｅｄｂｒｏｃｃｃａａ打ｄｅｘｏｎｕｃｅａ－ａｅｃｃｎｙｌｌｉ打ｉｒｌｅａｍｌｉｆｉｔｉｏ打ＵＧＡｌｓｅＩｌｌｉｄｄｒｅｌｉｐｇｐ（）ｙｇ＋ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｄ別ｅｃｔｉｏｎｓｏｆＡＴＰａ打ｄＫｗｅｒｅａｃｃｏｍｐｌｉｓｈｅｄｂｙｔａｋｉｎｇａｄｖａｎ化ｇｅｏｆｔｈｅ－－ｉｒｉ打ｈ化ｉｔｍｅｆｆｅｃｔｏｆＳＩｎｕｃｌｅａｓｅ．ＳＩｎｕｃｌｅａｓｅｉｓａｓｉｎｌｅｓｔｒａｎｄｅｄｓｅｃｉｆｉｃｇｇｐ－Ａ－ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｔｈｅｉｎｌｅｓｔｒａ打ｄｅｄ艮ＣｒｉｍｅｒｔＤＮＡｄｒｏｌｚｅｄｉｎｌｗｏｕｌｄｂｅｈ：ｏ，ｓｇｐ（）ｙｙｍｏ打ｏ打ｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｄｕｅｔｏｔｈｅｒｅｓｅｎｃｅｏｆＳＩ打ｕｃｌｅａｓｅｗｈｉｃｈｃｏｕｌｄ打ｏｔｃａｕｓｅｔｈｅ民Ｇ＿Ａｐ，ｒｅａｃｔｉ－ｔｔｉｏｎａ打ｄｓｕｂｓｅｕｅ打ＥｘｏｎａｉｄｅｄｒｅｃｃＵｎｇａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｒｅａｃｔｉｏ打ｒｅｓｕｌｉ打ｉｎｑｙ，ｇ＋－ｅｘｔｒｅｍｅｌｗｅａｋｆｌｕｏｒｅｓｃｅ打ｃｅ．Ｉｎｔｈｅｒｅｓｅ打ｃｅｏｆＡＴＰｏｒＫｔｈｅｃａｎｒｏｔｅｃｔｔＤＮＡｙｐ，ｙｐｆｒｏｍｔｈｅｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓｏｆＳＩ打ｕｃｌｅａｓｅ，ｗｈｉｃｈｓｕｃｃｅｅｄｓｉ打ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ民ＣＡｐｒｏｄｕｃｔｓａｎｄＥｘｏｉｎ－ｓｓｔ－ａｉｓｔｅｄａｍｐｌｉ打ｃａｉｏｎｏｆｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｓｉ打ａｌｓ．Ｔｈｅｔｕｒｎｏ打ｓｅｎｓｏｒｗａｓｇｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄｉｎｗｈｉｃｈｔｈｅｒｅｓｅｎｃｅｏｆＳＩｎｕｃｌｅａｓｅｃａｎｈｅｌｔｏｒｅｄｕｃｅｔｈｅｂａｃｋｒｏｕｎｄ，ｐｐｇ＋ｓｉｇｎａｌ，ｔｈｅｒｅｂｙｇｅｔｔｉｎｇａｎｉｎｃｒｅａｓｅｄｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ．ＡＴＰａ打ｄＫｃａ打ｂｅｄｅｔｅｃｔｅｄｉ打ａｒａｎｇｅｏｆ－－５２００ｎＭａｎｄ０．５５ｍＭｗｉ化ａｄｅｔｅｃｔｉｏｎｌｉｍｉｔｏｆ０．５ｎＭａｎｄ２ｎＭｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｉｎａｄｄｉｔｉｏｎｔｈｉｓａｒｏａｃｈｃａｎａｌｓｏｂｅａｌｉｅｄｆｏｒｉｎｈ化ｉｔｏｒｓｃｒｅｅｎｉｎｏｆｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ．，ｐｐｐｐｇＫｅｗｏｒｄｓ：ＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓＲｏｌｌｉｎｃｉｒｃｌｅａｍＨ巧ｃａｔｉｏｎＥｘｏｎｕｃｌｅａｓｅＩＩＩｙ；ｇｐ；；＾Ｍ－－ＳＩｎｕｃｌｅａｓｅｉｃｒｏＲＮＡＡｄｅｎｏｓｉｎｅ５ｔｒｉｈｏｓｈａｔｅ．；；ｐｐＶ 硕±学位论文目录学位论文原创性声明与学位论文版权使用授权书Ｉ摘要ＩＩＡｂｓｔｒａｃｔＩＶ第１１章绪论１１．巧光生物传感器１１丄１英光产生的原理２１丄２巧光生物传感器的分类２１．１．３焚光生物传感器的应用５１．２滚环扩増技术６１．２．１滚环扩増的原理６１．２．２滚环扩増的分类７１．２．３滚环扩增的发展与应用８１１０．３基于核酸切割酶的信号放大技术在生物传感中的应用１．３．１基于核酸内切酶的信号放大技术１０１．３２基于核酸外切酶的信号放大技术１１．１１３．４本论文构思第２章基于滚环扩増和核酸外切巧ＩＩＩ辅助循环的双重放大巧光传感器用于Ｓ１核酸ＩＳ的高灵敏检测１５２．１ｍｔ１５２．２实验部分１６２．２．１试剂和仪器１６．２１２．２环形探针的制备６２．２．３Ｓ１核酸巧的检测１７２．２．４滚环扩増反应１７２．２．５核酸外切酶ＩＩＩ辅助的循环放大１７２３结果与讨论１７．１２．３．实验原理１７２．３．２传感器的验证１８２１．３．３实验条件优化９ＶＩ 基于滚环扩增和核酸外切酶皿辅助循环放大的高灵敏巧光生物传感器研巧；２．３．４Ｓ１核酸酶的检测分析２３２．３．５选择性考察２５２．３．６实际样品分析２５２．４小结：２６第３章基于滚环扩増桥连的两次核酸外切酶ＩＩＩ辅助循环的多重放大黄光传感器用于ｍｉｃｒｏＲＮＡ的超灵敏检测２７３．１前胃２７３．２实验部分２８３．２．１试剂和仪器２８３．２．２环形探针的制备巧３．２．３核酸外切酶ＩＩＩ辅助的目标ｍｉｃｒｏＲＮＡ循环放大巧３．２．４滚环扩增反应巧３．２．５核酸外切酶ＩＩＩ辅助的巧光信号放大３０３．３结果与讨论３０３．３．１实验原理３０３３２．．传感器的验证３１３．３．３实验条件的优化３２３ｉ．３．４ｍｉｃｒｏＲＮＡ的检汲ｊ分析３４．３３．５选择性考察３４３．４小结３５第４章基于滚环扩増和核酸外切酶ＩＩＩ辅助循环的双重放大巧光传感器用于ＡＴＰ＋和Ｋ的检测３６４１．前ａ３６４．２实验部分ｎ４．２．１试剂和仪器３７４．２．２环形探针的制各３８＋４．２．３ＡＴＰ和Ｋ的检测３８４．２．４滚环扩増反应３８４．２．５核酸外切酶ＩＩＩ辅助的循环放大３８４．３结果与讨论３８４．３．１检巧ａ原理３８４．３．２传感器的验证３９４．３．３实验条件的优化４０＋４３４ＡＴＰ和Ｋ４１．．的检测分析ＶＩＩ 硕±学位论文４．３．５选择性考察４２４．４小结４３Ｓ论４４参考文献４５附录Ａ攻读学位期间发表的学术论义５９ｍ６０ｖｍ 硕壬学位论文第１章绪论一Ｗ经过生物传感这概念最先是由Ｃｌａｒｋ和Ｌｙｏｎｓ于２０世纪６０年代提出，５０多年的发展一，生物传感技术己经成为口多学科交叉综合的技术，与生命科学和信息技术息息相关，。随着人们对生命现象的探讨日益加深如何灵敏又准确地获取核一直是生命科学领域的关注点酸、蛋白质、酶活性Ｗ及生命小分子的信息。生物一传感器是类特殊的分析工具，它可将生命活动中难Ｗ检测的化学反应信号转化’３Ｐｌ主要由分子识别元件为光、热、电等可测量信号，、理化转化元件和信号处理装置Ｈ部分组成，。识别单元是由各种敏感的生物活性材料构成如亚细胞器、酶、抗体一、核酸等；理化转化单元般是压电石英晶体、电化学电极、光敏管和场效，应管等可将信号进行转化的检测元件；首先待测物质与识别元件特异性结合发生化学或物理反应，然后理化转换元件将反应中产生的代表生物学信息的信号转化为可检测的光电信号，，最后信号放大器再对转换后的信号进放大和处理从而４’５３ｔ，达到分析、检测目标物的目的。生物传感器因其灵敏、特异、便捷等优点在－ｗｕｅｓｉＷｉｔｔＡｌｔ生物医学、食品工业、环境监测国防等领域被广泛应用。１．１费光生物传感器一光学生物传感器是生物传感器中的种，它Ｗ被测物质与识别单元反应后引发的光信号为探测基础，再通过光信号转换和放大装置处理，输出可读的仪表数据进而换算出被测物质的信息，Ｗ此实现目标物质的定性、定量分析。构造如图＂＂１１，，．所示生物识别层是对目标物有高选择性识别能力的感应器它的作用是提取与各种被测定生物量有关的光信息，。信号转换装置将该信息进行转换再经过信号放乂装置进行放大和处理光学信号有很《种，如巧光、憐光、化学发■Ｕ光，因、折射、散射、干涉、巧曲、波导等此Ｊ根据光学信号的不同将光学生物传感器分为：巧光型、碟化型、化学发光型、紫外可见光谱型、拉曼散射型、表面等离子体共振型等。其中巧光信号为检测信号的巧光生物传感器最为常见。ＢｉｏｌｏｉｃａｌｇＴｒａｎｓｄｕｃｅｒＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎＡｎａｌｔｅｒｅｃｏｎｙｇｉｔｉｏｎｌａｙｅｒ＾？？＼ｉ—－ｉｈｔｓ－ＬＰｈｏｔｏｎｃｏｊｎｔＭＥｅｃｇｌｌ▲ｌｔｒｉｃａＳｉｇｎａＩＪｒ图１．１光学生物传感器的结构－－１ 基于滚环扩增和核酸外切酶ｍ辅助循环放大的高灵敏巧光生物传感器研究１．１．１黄光产生的原理每个分子都有其严格的电子能级一，而每个电子能级又包含了振动能级和转一动能级．２所示，基态用Ｓｏ来表示，而Ｓ和Ｓ２分别代表第，如图１ｉ电子激发单和Ｔ一重态和第二电子激发单重态，Ｔ２则代表第电子激发Ｈ重态和第二电子激发ｉＨ重态＝，用ｖ０ｌ２３．．．表示基态和激发态中的振动能级。单重态和Ｈ重态的区别，，，在于电子的自旋方向不同，由保利不相容定理可知，基态时，这些电子成对地存在于各个原子轨道中一，相反方向进行自旋。当基态分子的个电子吸收能量后，其被激发跃迁到高能级上，若自旋方向不发生改变，此时分子处于单重激发态；若电子在跃迁过程中伴随着自旋方向的改变，即两个电子均处于平行自旋，则为Ｈ重激发态。根据洪德规则，在分立轨道上的非成对电子，其平行自旋比成对自旋更加稳定，因此，兰重态比相应的单重态能级稍低。又由于Ｈ重态分子具有顺－４－８？ｓ磁性，，其寿命约为１〇Ｉ明显长于具有抗磁性的单重态分子（ｌ〇ｓ）。当基态分子吸收能量（光能、电能、热能、化学能）后跃迁到激发态，处于激发态的分子很不稳定，通常会Ｗ福射跃迁或非福射跃迁的方式返回基态，巧光就是其中的一种返回方式。当分子处于最低激发态的最低振动能级时，通过发射光子的福射ｔＷ跃迁方式回到基态时，便产生焚光。Ｓ３２ｍｍｍ－—＾＾約转＂．Ｉ．．ｔ２Ｉ｜方巧ｔＸ…苗ｙ场藏龍－－—－－：４Ｉ等．—ＷＰＮ＾－－－１ｒｔｗ图１．２分子吸收和发射过程中的能级图１．１．２黄光生物传感詣的分类焚光生物传感器是目前研究最为广泛一、发展也极为迅速的传感器之。当前报道的焚光生物传感器中，常用的方法有癸光光谱法（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｓｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙｐ，ＦＳ）、焚光各向异性／偏振法（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ？民）、焚光能量共振转移ｐ，－２－ 硕±学位论文法（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｒｅｓｏｎａｎｃｅｅｎｅｒｇｙｔｒａｎｓｆｅｒ，Ｆ民ＥＴ）和巧光相关光谱法（Ｆ山ｏｒｅｓｃｅｎｃｅｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｓｅｃｔｒｏｓｃｏＦＣＳ）。ｐｐｙ，１丄２．１基于巧光光谱的巧光生物传感器紫外或可见光照射某些物质后，，不同英光物质发射的波长位置不同反映着该物质的特性。巧光信号强度与该物质浓度成正相关关系，且某些茨光物质的发射波长位置和英光信号强度与其所处的微环境也息息相关。焚光光谱法就是利用上述原理进行定性或定量分析的方法。Ｔｅｍｌａ化ｒｏｂｅｐｐ＊，３５ＩＩＩ０Ｖ？（５ＨＩ女〇Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ３７ＣｄＮＴＰｓ＞，，ｏＴｏ（［ＴＴｍＴＴｍ＾Ｊ？：ＳｂｒＧｒｅｅｎＩ？ｙ？參參參争争争参争。。。（，公１１１川１川１１１讯！１川１川１１１！１『，至ＩＷ图１．３聚合巧辅助的巧光放大法用于束离子检测的原理图ＹＢＲ一ＳＧｒｅｅｎＩ是ＤＮＡ巧光嵌入染料最为常见的种，它能够结合在双链ＤＮＡ的双螺旋小沟区域。当ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩ处于游窝状态时，发出的黃光信号极为微弱Ｉ一旦结合到双链ＤＮＡ中，巧巧化信号则大大增强，且信号的强度与双链ＤＮＡ的数ｔＷ量相关。这种特性巧被用来检测参与形成稳定ＤＮＡ双链的目标物。Ｚｈｕ等报道一，，了种在聚合酶辅助下的巧光放大方法来灵敏地检测采离子原理如图．３１所示作者设计的模板探针由两部分组成：富Ｔ碱基的束离子识别序列（红色部分）和聚合酶巧伸的模板序列（黑色部分）：当体系中存在巧离子时，识别序列中的Ｔ碱基２＋Ｔ－Ｈ－Ｔ配和巧离子进行ｇ对，形成折叠的双链结构，从而诱发聚合酶从折叠双链的’３端开始延伸，最终形成Ｕ形的长双链结构ｅｅｎＩ，。再加入ＳＹＢＲＧｒ后可产生很强一－－的巧光信号，实现对巧离子的分析。此外，些与Ｇｕａｄｒｕｅｘ）还有凹联体（Ｇｑｐｌ－３－ 基于滚环扩增和核酸外切酶ｍ辅助循环放大的高灵敏巧光生物传感器研究ＰＷＰ１１Ｎ－ＣＶ）特异性结合的染料，如甲基叶琳二丙酸ＩＸ（ＮＭＭ）和结晶紫（等，用来构建能促使Ｇ－四联体形成的物质及其抑制剂的炎光传感器。１丄２．２基于巧光各向异性／偏振的黄光生物传感器一所谓偏振光，是指在任何平面都均匀振动的光波通过某物质时，受到该物质的作用被分成不均匀的光束，使平面振动发生变化，从而出现不同平面方向的振动有强弱之分，此时的光即为偏振光。巧光偏振现象是由Ｐｅｒｒｉｎ于１９２６年首次提出，它是指当溶液中的巧光物质受到平面偏振光激发时，如果巧光分子在受激发时保持静止，发射光则仍与激发光在相同的偏振平面。如果在受激发期间癸光分子处于运动或旋转的状态，发射光则与激发光不在相同的偏振面。偏振英光的强度与巧光分子的运动速度成反比，巧光分子体积越小，运动速度越快，受偏振光激发后产生的巧光强度则越小，。同时溶液的温度、分子间的相互作用等均会影响偏振英光的强度，因此该技术可被用来研究生命科学中分子间的相互作用、实时监测分子间的变化等。利用巧光偏振现象发展出的巧光传感器被用于小分子＾ＰＷＮＡＮ蛋白激酶气肿瘤细胞标记物的检测，Ｄ结构变化研巧及ＳＰｓＰＷ筛选。１２丄．３基于黄光共振能量转移的巧光生物传感器一巧光共振能量转移（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｒｅｓｏｎａｎｃｅｅｎｅｒｇｙｔｒａｎｓｆｅｒＦＲＥＴ）个，是指当焚光分子一（又称供体分子）的巧光发射光谱与另个英光分子（又称受体分子）的激发光谱相重叠时，供体巧光分子的激发光谱能诱发受体分子发出费光，同时供体焚光分子自身巧光强度减弱的现象：。要发生ＦＲＥＴ还需满足Ｈ个条件①供体一分子的发射光谱和受体分子的吸收光谱必须有显著的重叠，般大于３０％供；②－ｎｍ之间体分子和受体分子间的距离必须在１ｌＯ，才能发生较好的ＦＲＥＴ。供体和ＦＲＥＴＥ＝受体间的效率（Ｅ）可Ｗ通过下公式计算ｌ／（１＋（艮／民ｅｘ６：〇）ｐ），其＝中民０为福氏半径，即Ｅ５０％时供体和受体间的距离，对于特定的供受体对，该值为常数。Ｒ为供体分子和受体分子间的距离；③供体分子的发射态偶极矩与受体分子的吸收态偶极矩一、Ｗ及它们的向量必须满足定的条件。目前文献报道的巧ｇＰＳｐ一Ｉｉ些特殊的纳米光分子供受体对主要包括有机染料焚光蛋白，量子点和ＰＷ＂＂等，Ｆ艮ＥＴ材料。此外作为光谱尺成为检测生物活体和体外纳米级距离变一一－化的少数几个工具之，般认为１０，Ｆ艮ＥＴ可Ｗ用来测量１００Ａ范围内大分子之ＰＵ间的距离。因此ＦＲＥＴ在核酸检测，活细胞体内物质成像检测中、免疫分析中也被广泛应用，Ｄｕａｎｅｎｅｄｅ。例如等人基于氧化石墨稀（Ｇｒ叩ｈＯｘｉＧＯ）设计，－了种叶酸受体（ｆｏｌａｔｅｒｅｃｅｐｔｏｒ，Ｆ民）表达阳性细胞的成像探针（图１．４），该探针通过二硫键分别在ＧＯ上交联上了叶酸（仿ｌｉｅａｃｉｄ，ＦＡ）和罗丹明Ｂ（ＲｈｏｄａｍｉｎｅＢＲＢ），由于ＲＢ的与ＧＯ之间发生的ＦＲＥＴ，使得刚开始探针巧光很微弱，当，－４－ 硕±学位论文探针进入细胞后，二硫键被体内的谷晚甘肤切断，英光供体和受体两者分离，使巧光恢复，。因叶酸与癌细胞表面的叶酸受体特异的结合能力该探针具有定向打祀细胞的能力，使探针更容易被内吞进细胞。这种黄光増强型探针大大提高了信噪比，能很好的区分叶酸受体阴性和阳性细胞Ｗ及达到检测体内谷腕甘狀的目的。卢打４八乂ｂＩｒＷｌｕＵｒＧＳＨｎｔａｃ）＾ＦｏｌｋａｃＲｈｏｄｉ參ｉｄ奈ａｍｎｅ６ｓｏｔｈｉｏｃｙａｎｊＵ一Ｆｏｌａｔｅｒｅｃｅ口ｏｒＧｒａｈ？畑ｏｘｉｄｅｐ－Ｎ＊ｒｏｔｅ３－。ｉｖ）．ｐ１睾３２ｔｌ１－图．４ＧＯＲＢ的巧光能量共振体系用于活细胞中谷脯甘狀检测的原理图１．１．２４基．于黄光相关光谱的巧光生物传感器ｏｒｅｓｃｅｎｃｅｃｏｒｒｅ－ＦＣＳ茨光相关光谱（Ｆｌｕｌａｔｉｏｎｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）的原理是利用巧，＂＜光强度随时间的涨落进行分析检测。它可Ｗ测定微区内（１（Ｔｌ）巧光基团因布朗运动或化学反应而导致的巧光强度涨落，具有极高的灵敏度。它能够提供巧光一ｔｗ标记分子的大小、浓度和相互影响的信息，是种重要的单分子检测技术。随着理论和仪器的日益发展，茨光相关光谱在生命科学Ｗ及化学等领域的应用越来５ｆＷＰ１ＰＷ越广泛，在活体细胞分析、单分子检测、反应动力学研究、疾病早期诊断ｔｎｌ和药物筛选等方面发挥着重要作用。１丄３巧光生物传感器的应用茨光传感器具有操作简便、响应迅速、选择性好、灵敏度高的优点，其检出ｔｗ，在食品分析限可达到单分子水平、环境检测、临床诊断、药物研究等方面被泛使用。在食品安全领域，巧光生物传感器不仅可Ｗ用于食品中基本成分和添加剂的分析，还可用于检测食物中有害的微生物和农药残留。如Ｗａｎｇ等发展了一ＮＣ－）种检测黄曲霉素的巧光生物传感器，该方法氛接杂的碳点（ｄｏｔｓ作为，－巧光报导基团。起初由于静电作用，Ｎｓ，Ｃｄｏｔ被姐装在修饰了黄曲霉素核酸适配－ａｍｅｒ，体的金纳米颗粒（Ａｐｔ／ＡｕＮＰｓ）上，此时Ｎ，Ｃｄｏｔｓ的巧光被金纳米颗粒泮灭当体系中存在黄曲霉素时，核酸适配体发生构象隻化并与黄曲霉素结合，使－ｄｏｔｓＮＣ脱离金纳米颗粒，，从而检测到巧光信号该方法可简单、快速、特异、，灵敏地检测黄曲霉素，、大气。在环境检测领域巧光生物传感器主要可进行水质和±壤的监测－。可Ｗ对大气中氧化氮等污染物、水质中的有机质和止壤中的金－－５ 基于滚环扩增和核酸外切酶ＩＨ辅助循环放大的高灵敏巧光生物传感器研巧＾一ｌ属离子等进行检测。如Ｌ，可对化化和ＮＯ进行ｉｎ等合成了种有机巧光染料一ｆＷ响应，并发出可区别的巧光信号；唐等建立Ｉ种巧光分析法用来测定水样中的痕量讲，。在临床医学和药物研究领域不论是研究细胞早期调亡还是检测ｆ４３ｌＷｆ癌细胞标志物，或者是检测流感病毒ＲＮＡ的巧光生物传感器都相继被研究，并有望继续发展。１．２滾环扩增技术一滚环扩増（ＲｏｌｌｉｎｇｃｉｒｃｌｅａｍｌｉｆｉｃａｔｉｏｎＲＣＡ）是种简单而又有效的等温核酸ｐ，，这项技术建立于８８，扩增过程１９年是模拟自然界中质粒和幢菌体等环型ＤＮＡ分子的复制方式提出。该技术Ｗ环形的单链ＤＮＡ为模板，在聚合酶的存在下，将退火到环形模板上的引物链不断延伸，从而产生含有成百上千个串联重复序列的单链ＤＮＡ。它有着极强的扩增能力，整个过程可在液相、固相或复杂的生物环境中ｔＷ，，恒温进行无需热循环仪器具有特异、灵敏、快速、操作简便的特点。１．２．１滾环扩增的原理一滚环扩增反应的原理是Ｗ封闭的单链ＤＮＡ环为模板，Ｗ与模板环中段非功ＤＮＡ’能序列互补的单链为引物，在聚合酶作用下，从引物ＤＮＡ链的３端开始沿着模板环扩增，最后形成整数倍模板环长度的单链ＤＮＡ。典型的民ＣＡ反应由四个部分组成：（１）ＤＮＡ聚合酶Ｗ及合适的反应缓冲溶液；常见的ＤＮＡ聚合酶有Ｐｈｉ２９ＤＮＡ－聚合酶，ＢｓｔＤＮＡ聚合酶和ＶｅｎｔｅｘｏＤＮＡ聚合酶。而Ｐｈｉ２９ＤＮＡ聚合酶因其超强的持续合成能力和链置换能力被广泛使用，它的链合成能力大于７０ｋｂ，即使模板ｔＷ环的次级结构比较复杂，其扩展性和链取代能力也不受影响。（２）憐酸脱氧核糖核昔酸（ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｔｒｉｐｈｏｓｈａｔｅｓｄＮＴＰｓ）作为合ｐ，；成ＤＮＡ链的原料分子，是构建ＲＣＡ产物的基础。—（３ＤＮＡ５－）单链般待环化的单链ＤＮＡ的长度约为２００个碱基，可通１环形；’’过酶促的或者化学的方式将其５憐酸端和３经基端进行分子内连接，从而形成环。根据两端连接的过程中是否需要辅助其它单链ＤＮＡ（连接探针），可将成环的方＂＂＂＂４７＂＂式分为模板介导成环和非模板介导成环两种１＾模板介导成环原理’，５如图１．５所示是指将待环化的寡聚核昔酸链（也称为挂锁探针的端憐酸化，’’５３一一且其端和端均有段与辅助链互补的序列，在定条件下，挂锁探针和连接探，形成周部互补双链结构针进行杂交，从而拉近挂锁探针的两端，在ＤＮＡ连接酶＂＂的作用下，挂锁探针被连接成环，得到单链环状的ＤＮＡ。非模板介导成环是ＮＡ可Ｗ直＾指，环形Ｄ接通过种特殊的连接酶（ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ）将待环化的单链ＤＮＡ首尾两端进行连接而得到。一（４）引物ＤＮＡ链引物ＤＮＡ链是指引发艮ＣＡ反应的条单链ＤＮＡ，它能与环；－６－ Ｉ硕±学位论文形ＤＮＡ互补，从而被延伸得到ＲＣＡ产物。它可Ｗ是待检测的目标ＤＮＡ链，也可Ｗ将其作为前面提到的连接探针，并由此设计环形ＤＮＡ两端的序列，从而大大降低非目标ＤＮＡ链的干扰。叫ａ四ｍｐｌａｔｅ如＂ＰｕＨｆｃｎ＾＾ｉ＾ｔｏ＾＾ＣｉｒｃｕｌａｒｔｅｍｐｌａｔｅＸ＿＿ＪＶｙ＂，，４７［］图１．５模板介导成环的原理图１．２．２滚环扩増的分类＂＂＂＂ＲＣＡ的分类，按照引物数量分可Ｗ分为单引物ＲＣＡ和多引物ＲＣＡ；＂＂＂＂ＩＷ按照扩增效率分可分为线性ＲＣＡ和指数ＲＣＡ。１２２１．．．线性ＲＣＡ一线性ＲＣＡ即为单引物ＲＣＡ，在扩增反应中，将条引物ＤＮＡ链退火到环形ＤＮＡ上与之杂交结合，在ＤＮＡ聚合酶作用下Ｗ环形ＤＮＡ为模板合成其互补ＤＮＡ链，当合成至引物结合位点时，有链置换活性的ＤＮＡ聚合酶把己合成的引物延伸链从环形ＤＮＡ模板上置换下来，并Ｗ环形ＤＮＡ为模板继续合成，最终得到与环形ＤＮＡ完全互补序列串联而成的单链线性ＤＮＡ（图１．６Ａ）。ＲＣＡ１２．２．２．《引物一多引物ＲＣＡ是相对于单引物ＲＣＡ提出的个概念，，顾名思义它是指引发一ＲＣＡ反应的引物ＤＮＡ链不止一条，即由个多复制起点的环状ＤＮＡ模板和多条引物ＤＮＡ链进行的ＲＣＡ反应，从而得到多重的民ＣＡ产物１．６Ｂ）。（图最多可容纳的引物链数量取决于环状ＤＮＡ模板和引物ＤＮＡ链的长度。１ＲＣＡ．２．２．３ｔ旨数指数ＲＣＡ也被称为级联滚环扩増（ｃａｓｃａｄｅｒｏｌｌｉｎｇｃｉｒｃｌｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ＣＲＣＡ）、超分支滚环扩增（ｈｅｒｂｒａｎｃｈｅｄｒｏｌｌｉｎｃｉｒｃｌｅａｍｌｉｆｉｃａｔｉｏｎＲＣＡ）ｙｐｇｐ，或分支扩増一（ｒａｍｉｆｉｃａｔｉｏｎａｍｉＲＡＭＲＣＡｌｉｆｉｃａｔｏｎ）。，ｐ，它的原理类似于线性但却不止种引ＮＡ一，第种引物ＤＮＡ链，物Ｄ链。首先（Ｐｒｉｍｅｒ１）与环形ＤＮＡ互补杂交进行滚－－，这个过程与线性ＲＣＡ致，第轮线性ＲＣＡ的扩增产物可与环置换合成。然后二种引ＤＮＡ链一第物（Ｐｒｉｍｅｒ２）互补杂交，Ｐｒｉｍｅｒ２再第轮线性ＲＣＡ的扩増产一物为模板进行酶促延伸，得到新的ＤＮＡ链，。随着第轮线性ＲＣＡ的进行更《的Ｐ一ｒｍｅｒ，ｅｒ，．ｉ２结合到第轮线性ＲＣＡ的扩増产物上得到更多的Ｐｒｉｍ２巧伸链此时Ｐｒｉｍｅｒ１又可Ｗ结合到Ｐｒｉｍｅｒ２延伸链上进行酶促巧伸，如此循环化复，短时间内一一ｗ’ｓｉｔ］１产物呈指数扩増，最终得到系列长度不的双链产物（阐．６Ｃ）。Ｎｉｋｏｎ等研究发现，线性ＲＣＡ产物与互补的含限制性内切酶位点的ＤＮＡ片段杂交后，可Ｗ－７－ 基于滚环扩增和核腹外切船川辅助祀环放大的商灵敏巧光生物传感器研妃被限制性内切酶切割成多个片段，然后在模板介导下被连接酶连接成多个环形ＤＮＡ，这些新的环形ＤＮＡ作为其它引物ＤＮＡ的模板进行ＲＣＡ反应，得到的民ＣＡ产物也呈指数型増长（图１．６Ｄ）。ｏｄＮＴＰｉｄＮＴＰｔ－ｄｃｊ—Ｐ：Ｈ＾ｆｌ？？ｒｒｔ１Ｉ＾２丄ｔｏｒ＾ｔｔＷｌＢｉｔｆｃｉ口＇Ｔ」文ｎｍｔｒｉ＾ａｔｍｙｉｍ＾——＂ｂ＂＊—＿ｉ－＇＇古。Ｗ；？＾ｈｉ—户００００＇＊ｌ－ｉｙ．八ｑ＾ｏｐ＾４７［１１图．６滚环扩增的分类１．２．３滚环扩増的发展与应用相对于目前应用较为广泛的ＰＣ民核酸扩增技术而言，ＲＣＡ无需复杂的温控循环仪，不仅可Ｗ直接将特定ＤＮＡ分子进行扩增，还能将範核酸的信号进行放大，且反应在恒温下进行，反应条件温和，可用于快速的现场诊断。产物始终连接在靴物质或者固相支持物上，不仅可＾式在试管内扩増，还可微阵列和细胞原位上扩增。民ＣＡ扩增技术在核酸测序、ＤＮＡ忘片、单核昔酸多态性检测、细胞原位检测Ｗ及蛋白质、病原体和小分子检测中有着诱人的应用前景。１．２．３．１在全基因组ＤＮＡ检测中的应巧ＲＣＡ技术的发展，使扩增的对象不再仅限于质粒、唆菌体、病毒等这类环形，还可ｙ的核酸分子？用于线性核酸的扩增，如利用核酸酶抗性引物和ｐｈｉ２９ＤＮＡ聚合酶进行的全基因组扩増技术。现己报道的利用民ＣＡ技术进行全基因组扩增的一方法主要有两种：种是多重替换扩增ｈｉ２９ＤＮＡ聚合酶从十个＾；它是利用ｐ＞下的人类细胞里精确扩増出全基因组°ＤＮＡ，产物平均长度超过ｌＯｋｂ，在３０Ｃ下扩増４？６ｈ即可达到反应平台。该方法也可在全血中扩增出体内的基因组且无需进行ｉｎｉ一ＤＮＡ纯化．。另种是限制性环化滚环扩增首先利用限制性内切酶将基因组ｔｗｉＤＮＡ消化成短的片段，然后再环化成单链环形ＤＮＡ，最后进行滚环扩增。－８－ 硕±学位论文１．２．３．２在ＤＮＡ芯片中的应用将ＲＣＡ结合到芯片技术中，可Ｗ很好地克服传统核酸扩増技术不能在巧片上扩増的问题。在不同位点标记不同寡核昔酸探针的微阵列上，先让检测模板与其杂交，然后加入ＤＮＡ连接酶，只有与模板链互补的探针方能被连接成环，接着对成环的ＤＮＡ链进行滚环扩增，通过检测扩增产物的信息即可得到模板的信息。送种放大技术使检测低丰度突变成为可能，在肿瘤早期中的核酸检测和监控中十分、具有潜力。两种技术的结合可多重检测多个热点突变位点，具有高特异性高分辨率和高通量的特点。１．．２．３３在单核巧酸多态性检测中的应用单核昔酸多态性（ｓｉｎｇｌｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ，ＳＮＰ）也称为单碱基改变，它是指基因组中单个碱基的变异而引起ＤＮＡ序列的多态性，是人类可遗传变异中一一最常见的￣种，其数目十分庞大，大约每１００３００个碱基中就有个碱基发生突变。一一基于ＲＣＡ来检测般是先设计’端设计为单核ＳＮＰ的方法，种挂锁探针，探针的３巧酸多态性位点’，且两端与目标核巧酸互补。在ＤＮＡ连接酶存在下，３端与ＳＮＰ位点互补的挂锁探针被连接成环，进而成为ＲＣＡ反应中的环形模板进行扩増。这，样，利用挂锁探针与目标ＤＮＡ连接与否来区分ＳＮＰ的位点利用民ＣＡ来增加检测灵敏度。１．２．３．４在细胞原位检测中的应巧细胞在不同分裂周期中染色体的变化情况可用原位检测进行分析，传统的方法是通过检测与祀核酸序列互补杂交的巧光探针的巧光信号来实现，这种方法灵敏度较低。而原位民ＣＡ技术通过挂锁探针和帮核酸序列互补杂交后再连接成环，紧接着发生后续的ＲＣＡ，在细胞内的靴核酸上延伸出大片段扩増产物，既能提高检测的灵敏度，又可克服原位ＰＣＲ中产物扩散出细胞的缺点，且反应条件温和，ｔＷ细胞的结构可免遭破坏。Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ等利用ＲＣＡ技术对固定化细胞在原位进行单城基突变和基因拷贝数目检测，其效率超过９０％。１．２．３．５在免疫检测中的应用免疫微阵列是利用抗原和抗体间特异结合而发展起来的一种广泛应用于疾病诊断Ｗ及药物和药範筛选的技术，具有操作简单、恃异性好等优点，将ＲＣＡ技术与免疫学方法相结合，避免了传统信号扩増方法的限制，从而实现高通量、髙灵。ＲＣＡ敏地检测目标物质免疫检测步骤如下：①将捕捉目标物的特殊抗体固定在芯片上；②加入能与目标物结合的、标记了生物素的二抗；③结合了寡核巧酸单链引物的通用抗体与二抗结合；④通用抗体上的寡核昔酸引物引发ＲＣＡ反应。Ａｋｔｅｒｓｔｙ等利用双抗体夹也来捕获人干扰素ｙ－ＲＣＡ反应（ＩＦＮｙ），进而引发，检测限达－９－ 基于滚环扩增和核酸外切酶ｍ辅助循环放大的高灵敏巧光生物传感器研巧ｆＷ到６２．５ｐｇ／ｍＬ，灵敏度远远高于常规方法。Ｔａｎｇ等用核酸适配体（ａｐｔａｍｅｒ）代替’ＣＡ引抗体来捕获靴物质，直接在ａｐ化ｍｅｒ序列３端加上民物核酸序列，Ｗ启动民ＣＡ，避免了抗体蛋白和寡核酸链的交联反应，使操作更为简便。１．２．３．６在纳米生物技术和材料科学中的应用一－克里克碱基配对使ＤＮＡ成为构建系列纳米或微米级框架的基石沃森。通，可使ＲＣＡ产物成为分子内互补配对过设计环形ＤＮＡ模板序列、自我组装的、被赋予多种功能的纳米或微米级ＤＮＡ材料，这些材料仍具有核酸的性质，在细胞成像和药物範向输送中拥有强大的应用前景。如Ｔａｎ等利用ＲＣＡ技术得到类似于花的形状的ＤＮＡ纳米结构，通过设计扩增过程中环形ＤＮＡ模板的碱基序列，＂使得到的ＲＣＡ产物可Ｗ进行分子内互补配对，进而自组装成大小可控的ＤＮＡ＂纳米花，ＤＮＡ模板上还。不仅如此环形设计了与可附着药物的碱基序列和可识＂＂别癌细胞的ａｐｔａｍｅｒ序列互补的碱基序列，从而将纳米花变成可将抗癌药物定向输送至癌细胞的核酸纳米材料，。此外该小组还将标记了巧光基团的脱氧核糖＂＂核巧酸作为ＲＣＡ反应的原料，合成了彩色的纳米花并应用于细胞成像中，提高了成像的分辨率１．３基于核酸切割酶的信号放大技术在生物传感中的应用＾灵敏度是衡量生物传感器好坏的个重要的指标，为了提高检测的灵敏度，各种放大策略在生物传感中屡见不鲜，其中包括对目标物的放大和对信号分子的放大，在这些放大方法中，核酸切割酶因其特异的底物识别能力和高效的酶催化能力被广泛使用。下将对几种常用的核酸切割酶辅助的信号放大进行技术简单的介绍。１．３．１基于核酸内切酶的信号放大技术一ｅｎｄｏｎｕｃｅａ一核酸内切酶（ｌｓｅ）是种可Ｗ水解ＤＮＡ链中憐酸二醋键的种酶，一根据其是否有特异识别的序列，将其分为两类：类是非限制性内切酶；这类内切酶对切割序列没有特定要求，可Ｗ水解单链或双链ＤＮＡ，产生单个或小片段的脱氧核糖核昔酸一。另类是限制性内切酶；这类内切酶可识别特定的ＤＮＡ序列，一并且从识别位点或位点附近切割双链ＤＮＡ，产生个切口。许多性能优越的生物５９＇６２ｗ一１１ｔｉ一传感器利用限制性内切酶这特性被设计。例如，Ｘｕ等利用种ｎｃｋｉｎｉｇ限制性内切酶（ＮＥａｓｅ）构建了目标物放大的金纳米颗粒比色传感器用于ＤＮＡ的’，检测。原理如图１．７所示，ｌｉｎｋｅｒ链ａｂ上有ＮＥａｓｅ的特异识别位点，当体系中’’不存在靴ＤＮＡ链时，ｌｉｎｋｅｒ链可免遭酶切、保持完整，其上的ａ端和ｂ端可分别与金纳米颗粒上的ａ，ｂ链互补杂交，从而拉近金纳米颗粒的距离，溶液呈蓝紫色；但当目标链ｔａｒｇｅｔ存在时，它与ｌｉｎｋｅｒ互补杂交，ｌｉｎｋｅｒ链上的特异识别位点被酶－－１０ 硕±学位论文’’，并被切成ａ和ｂ两段，金纳米颗粒的距离不能被拉近，溶液颜色呈红色识别。６一ｔ同时ｔａｒｅｔ，并继续与其它ｅｒ，循环放大。Ｌｉ等种限ｇ被释ｌｉｎｋ链结合叫昔助另制性内切酶ＢｓａＢＩ采用类似的原理检测了ＤＮＡ。ｎｉｉｃｋｎｇｅｎ日ｏｎｕｃｔｅａｓｅ＼ｍｉｓｍａｔｃｈｅｄ＇ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｅｒｙ＼ｒ．ｔａｇｅｔ图１．７基于限制性內切酶信号放大的金纳米颗粒比色传感器用于ＤＮＡ检测的原理图另外，非限制性核酸内切酶也可被用于构建信号循环放大的生物传感器。Ｔａｎｇ？一等［］将标有电化学活性物质的核酸适配体与磁性石墨帰结合构建了种对多个目标物同时检测的电化学生物传感器，单链的核酸适配体被吸。当不存在目标物时附到石墨帰上，使其免遭核酸酶ＤＮａｓｅＩ的水解，此时可レッ检测到较强的电化学，，信号，从而脱离石墨蹄复。当目标物存在时核酸适配体与目标物形成复合体合物中的ＤＮＡ因失去保护被核酸酶ＤＮａｓｅＩ水解，目标物被释放，被释放的目标，诱发酶切循环物又能与脱附石墨贿表面上的其它核酸适配体。如此往复，电化１８）学信号因绝大部分的电活性物质远离电极表面而降低（图．。ｔ＞？〇ａｓａｉｍｒ冷宁如々－Ｉ图１．８基于非限制内切巧信号放大的电化学传感器１．３．２基于核酸外切酶的信号放大技术－一一二核酸外切酶（ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ）是类可Ｗ从核酸分子的端逐水解麟酸酷键从而得到单个核巧酸的酶，它们对ＤＮＡ序列没有要求，但有些核酸外切酶对ＤＮＡ一一末端有定的识别性，因而在用于设计生物传感器的上有定的灵巧化。按照作用的底物链是单双链的区别，可Ｗ将其分为切割单链的核酸外切酶和切割切链的核酸外切酶Ｉ（ＥｘｏＩ）ＶＩＩ（Ｅｘｏ。切割单链的核酸外切酶有核酸外切酶和核酸外切酶ＶＩＩ）等。切割双链核酸外切酶有？Ｉ喧菌体外切酶ＵＥｘｏ）和核酸外切酶ＩＩＩ（ＥｘｏＩＩＩ）ＤＮＡＩＷ等，化腐用不。有文献报道利用人隨菌体外切酶进行信号放人Ｗ检测的研巧－Ｕ－ 基于滚环扩增和核酸外切酶ＩＩＩ辅助涌环放大的高灵敏英光生物传感器研巧；’’３－５如核酸外切酶，ＩＩＩ广泛。核酸外切酶ＩＩＩ可沿方向逐步水解ＤＮＡ链其最适底物’’是有着平齐或凹陷的３端的双链ＤＮＡ，对３端凸出的双链ＤＮＡＷ及单链ＤＮＡ无活６４６５’［］石墨帰性，该酶也常常与氧化、量子点、分子信标等材料联合构建各种生物传感平台。６７一２４３〇等［１利用氧化石墨帰和核酸外切酶ＩＩＩ构建了种循环放大的夷光生物传感平台Ｗ灵敏、快速地检测ＤＮＡ。当体系中不存在目标ＤＮＡ时，与目标ＤＮＡ序列’互补的、５端标记了英光素的单链ＤＮＡ探针被吸附到了石墨蹄表面，由于核酸外切酶ＩＩＩ不水解单链ＤＮＡ，焚光素的夷光被浑灭。若目标ＤＮＡ存在，它将与探针ＤＮＡ互补杂交，巧光重新恢复。在形成的双链，形成的双链ＤＮＡ离开氧化石墨赌表面ＤＮＡ中’ＤＮＡＤＮＡ因’，ＥｘｏＩＩＩ从探针ＤＮＡ的３端水解双链，目标其的３端凸出而免遭酶切，被释放后重新与探针杂交，，目标物循环使得信号不断放大检测限达到２０ｐＭ（图１．９）。Ａ．ＩｌＩ＂ｌ．１＇ＡｍｐＨｆｌｅｄ＾ｉ＂＂？ｓｅｎｓｉｒ＾ｇ＾Ｉ＾＇＾＼／ＷＶ／＋ｗｖ／了ａｒｇｅｔＤＮＡＰｒｏｂｅＤＮＡ６７＞（图．９ｘｏＩＩＩ１基于氧化石墨蹄和Ｅ检测ＤＮＡ的信号循环放大黄光平台Ｘｕａｎ等利用分子信标和核酸外切酶一ＩＩＩ构建了个超灵敏的电化学传感平’台，分子信标不仅标记了亚甲基蓝，其３端也被设计成凸出的结构。起初，由于核酸分子带负电且分子量较大，检测到的电信号十分，使得电活性物质远离电极微弱’。当目标ＤＮＡ与分子信标杂交后，发夹结构被打开且形成分子信标的３端平ＤＮＡ的’ＤＮＡ齐３端凸出的双链，在核酸外切酶ＩＩＩ的辅助下，分子信标被切、目标除．１０）。，目标ＤＮＡ循环，亚甲基蓝基团被释放到电极表面，电信号增强（图１－－１２ 硕±学位论文＇＊ｅＭＢｒｏｂｅｐ＊＇＊－〇００００＞＾Ｘ／ｖ／＾＾＾Ｐｓ＾／ＸＡＣＩＶ？＇ＡＣｔｅａｗｄＷＴＩＩＩ、订。说成＜曲ｓｕｒ＾ｃｅ—＿＿＿＊＂＂＂■５＾ｒＴ＾品皆只ｅｔｅｓｅｄＴａｒｇｅｔＯＮＡ１八在Ｊ．＊＊－—Ｃｓ＿＿ｌｉｒＢｔＤＮＡｉｎｕｔｇｐｉｗ图１．１０基于Ｅｘｏｉｎ和分子信标的超员敏电化学传感平台１．４本论文构思基于上述论述，在查阅大量文献及深刻调研之后，围绕当前较受关注的核酸酶，ＩＩＩ、生物小分子、核酸等研究对象本论文拟将滚环扩增技术、核酸外切酶辅助循环放大技术与费光生物传感方法相结合，构建多重放大的超灵敏巧光生物。传感平台来特异地检测这些物质具体内容如下：（１）将滚环扩增ＲＣＡ）ＩＩＩ（Ｅｘｏｉｎ）辅助放大相结合，扩（和核酸外切酶增出民ＣＡ产物后，在ＥｘｏＩＩＩ的帮助下，利用预先设计的、与ＲＣＡ产物互补的ＴａｑＭａｎ一Ｍ’探针进行巧光分析。旦Ｔａｑａｎ探针与ＲＣＡ产物杂交，ＴａｑＭａｎ探针的３端将变成凹陷状态，进而被ＥｘｏＩＩＩ酶切水解，英光报导基团脱离巧灭基团从而产生巧光信’Ｍ号。而３端凸出的ＲＣＡ产物则免遭酶切，可继续与其它Ｔａｑａｎ探针杂交，进行信号第二次放大。利用ＲＣＡ反应需耍引物链引发的特点，将引发ＲＣＡ反应的引物链设计成Ｓ１核酸酶作用的底物链（ｓＤＮＡ），当体系中存在Ｓ１核酸酶时，ｓＤＮＡ被水解成单个或短片段的核巧酸．导致ＲＣＡ因缺乏引物链而无法产生与ＴａｑＭａｎ探针互补的产物，使ＥｘｏＩＩＩ不能酶切ＴａｑＭａｎ．无巧光信号产生。巧光强度的减弱程度与Ｓ１核酸酶的浓度有关，Ｌ：ＪＳ１核酸酶的灵敏检测。ｌ此来实现对（２）利用滚环扩増ＩＩＩ（ＥｘｏＩＩＩ）循环放大相连（ＲＣＡ）将两次核酸外切酶一Ｅｘ－－Ｅｘｏ接ｏｍ民ＣＡＩＩＩＮＡ，，按照顺序进行Ｈ次信号放大。通过设计种发夹Ｄ’一ｉＲＣＡ其３凸出端序列与目标ｍｉｃｒｏＲＮＡ大部分互补Ｗ识别鞭标，另端序列ｊ中的ＤＮＡ模板互补，形成环形，当体系中存在目标ｍｉｃｒｏＲＮＡ时，发夹ＤＮＡ将被打开’’’原发夹ＤＮＡ的３端平齐３，ＥｘｏＩＩＩ３平、目标物端的凸出双链结构将从原发夹链的齐端水解双链部分，释放出目标物和引发ＲＣＡ反巧的引物链，目柄；物将重新打开ＮＡ一，二次信号放其它发夹Ｄ，进行第次信号放大引物链引发ＲＣＡ反应，进行第－－１３ 基于滚环扩增和核酸外切庚ＩＩＩ辅助循环放大的离灵敏巧光生物传感器研究Ｔ’大。得到的艮ＣＡ产物将再与单链ＴａｑＭａｎ探针互补杂交，使ａｑＭａｎ探针的３端凹陷，并被Ｅｘｏ山水解，使ＴａｑＭａｎ链上的巧光基团与浑灭基团分开，发射出英光信号。同时ＲＣＡ产物与其它的ＴａｑＭａｎ探针将继续杂交，进行第三次信号放大。通过ＥｘｏＩＩＩ不断酶切，巧光信号大大增强，来实现对ｍｉｃｒｏＲＮＡ超灵敏地定量检测。（３）利用滚环扩増（ＲＣＡ）和核酸外切酶ＩＩＩ（ＥｘｏＩＩＩ）辅助循环的双重放＋大战略，通过ＡＴＰ或Ｋ对Ｓ１核酸酶活性的抑制，将保护民ＣＡ反应的引物链不被水解，ＩＩＩ，使ＲＣＡ反应得进斤并顺利地发生后续的核酸外切酶辅助巧光信号放大反应，英光大大増强，根据巧光值的改变量Ｗ实现对目标物灵敏、定量地检测。－－１４ 硕±学位论文第２章基于滚环扩增和核酸外切酶ｍ辅助循环的双重放大费光传感器用于Ｓ１核酸酶的高灵敏检测２．１前言Ｓ一１核酸酶是种能催化核酸分子水解成单个核巧酸或小片段核昔酸的核酸内切酶。这种水解反应在细胞内的生物过程Ｗ及许多生物技术中发挥着重要的作用，ＷＷＷ例如：基因的修复、重组、复制、转录Ｗ及分子克隆、基因分型和映射等。ＭＳｔｌ传统的１核酸酶检测方法主要包括放射性同位素标记法、聚丙痛胺凝胶电泳法５７６７７７８’７９Ｐ，ｔｌ１１１、高效液相色谱法科及酶联免疫分析法等。这些方法费力、耗时而且ＳｆＷ操作较为复杂，部分方法还存在需要同位素标记的缺点。近些年来，，为了克服传统方法的缺点，其它检测核酸酶活性的技术相继出现８２，一如电化学技术Ｗｌ和光学技术些可附着在ＤＮＡ上的分子。例如，，如珪杂环戊８３ｓｓ’ｓｉｗ一￡１二婦分子、二蔡嵌苯衍生物分子及金纳米颗粒，旦核酶将ＤＮＡ水解，将导致这些分子的聚集状态发生改变，进而引起溶液的英光或颜色改变，此来ｗ０—９３一ｓｗｓｉｆｉＰ】ｆ检测核酸酶。此外，些诸如碳纳米管、氧化石墨婦、金属原子纳米簇一等纳米材料也被用来构建分析核酶的探针。我们小组就设计了种ＷＤＮＡ为合成－模板的银纳米簇（ＤＮＡＡＮＣｓ）探针。该探针属于巧光增强型，它基于的原理是ｇ－ＡＮＣｓ靠近时，当富鸟囑吟的ＤＮＡ序列与ＤＮＡｇ，银纳米簇的焚光会急剧増强利用ｗｔｉ该现象来灵敏又简便地检测核酸内切酶。上述这些方法虽然可Ｗ避免传统核酶、检测方法的缺陷，但是仍然存在着灵敏度不够好耗材昂贵、合成步骤复杂等不足。出于此，本章利用滚环扩増技术（ＲＣＡ）和核酸外切酶ＩＩＩ辅助循环技术进行双重放大一种特异性识别单链脱氧核，从而超灵敏地检测Ｓ１核酸酶。Ｓ１核酸酶是Ｍ’ＷｆＳ１核酸酶的基底单链ＤＮＡ（ｓＤＮＡ）被设计为ＲＣＡ糖核昔酸的核酸内切巧，一中的引物链，它可Ｗ与环形模板杂交，并在定的反应条件下启动扩増产生由无数重复序列构成的ＲＣＡ产物。同时，使用可与ＲＣＡ产物互补杂交的ＴａｑＭａｎ探针一’３作为报导探针，该探针ＤＮＡ序列的中间和端分别标记个巧光基团和巧光浑灭基团，此时，由于二个基团巧距很近．他们之间发生的灾光能量共振转移使巧光一旦与ＲＣＡ产物杂交后ａＭａｎ探针新基团的巧光被泽灭。，核酸外切巧ＩＩＩ就可从Ｔｑ’凹陷端开始水解该探针形成的３，从而释放出巧光基团，产生巧光信号。与此同’Ｍ时，由于ＲＣＡ产物的３端是凸出的，因而可免受酶切并继续与新的Ｔａｑａｎ探针循环杂交获得明显増强的巧光信号。当存在Ｓ１核酸酶时，ｓＤＮＡ被水解成单个或短片－－１５ 基于滚环扩增和核酸外切酶ｎｉ辅助循环放大的高灵敏巧光生物传感器研究段的核巧酸，因为缺乏引发ＲＣＡ的引物链，致使后续反应无法继续进行，检测不到巧光信号。因此，通过测定英光强度变化便可实现核酸酶的检测。整个反应无需温控循环的复杂仪器，且直接将Ｓ１核酸酶的反应底物作为ＲＣＡ反应的引物链，一避免了复杂的设计，是种易于操作的，超灵敏地检测Ｓ１核酸，又经过双重放大酶的方法。２．２实验部分２．２．１试剂和仪器本章中使用的所有核巧酸链均由上海生工生物工程股份有限公司合成（序列－１见表２．１），并且都经过ＨＰＬＣ纯化。Ｓ１核酸酶（１００Ｕ阵）从ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ公司购买，Ｓｌ核酸酶的缓冲溶液（２０ｍＭＮａＡｃ１５０ｍＭＮａＣｌ１＾＾及１ｍＭＺｎＳ〇Ｈ，４，ｐ４．５）用于ＳＩ核酸酶的稀释Ｗ及酶切反应，核酸外切酶ＩＩＩ、ＢｓｔＤＮＡ聚合酶（大片段）．ｃｏｌｉＤＮＡ连接酶、脱氧核糖核昔酸混合液（ｄＮＴＰｓ）Ｗ及ＢＳＡ均从Ｎｅｗ、ＥＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ（Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ，ＵＳＡ）购买。其他所有试剂均为分析纯，且都从ｏｒｅＭ－上海国药集团化学试剂有限公司获得。所有的试剂均用由ＭｉｌｌｉｐｉＵｉＱ超纯水仪（ＢｉｌｌｅｒｉｃａＭＡＵＳＡ）净化的超纯水配制，电阻率大于１８．２ＭＱ。，，巧光检测仪器为Ｆ－７０００ａｃｈ巧光分光光度计（ＨｉｔｉＪａａｎ），Ｔａｍａｎ探针的激，ｐｑ４９２ｎｍ５１０－ｒｕｎｃｍ，巧光发射光谱扫描范围为６００１，发波长为，的标准石英比色皿激发光和发射光的狭缝宽度均为５．０ｒｕｎ，检测电压为９５０Ｖ。２ＮＡ表．１本实验中所使巧的Ｄ序列信息’，序列一（５３）＾．ｓＤＮＡＧＴＡＧＧＴＴＧＴＡＧＧＡＧＧＡＧＡＡＴＴＧＧＧ挂锁探针ＰＯｒＣＣＴＡＣＡＡＣＣＴＡＣＡＡＡＣＣＴＣＧＡＣＴＧＣＡＡＧＣＴＣＴＣＣＧＡＣＣＴＡＣＣＣＡＣＣＡＣＣＣＡＡＴＴＣＴＣＣＴＴＭ－ａｑａｎ探针（ＦＰ）ＣＧＡＣＣＴ（ＴＡＭＲＡ）ＡＣＣＣＦＡＭ２．２．２环形探针的制备６５ｘ５０ｍＭＴｒ－将的杂交缓冲液（１ｉｓＨＣｌＨ８．０，５００ｍＭＮａＣｌ２０ｍＭ，ｐ，ＭｇＣｂ），８［ｉＬ挂锁探针（ｌＯｍＭ）ｉ＾Ｊｌ及１０＾ｉＬ连接探针（ｓＤＮＡ）混合，并将混°５Ｃ保持１０ｍｉｎ３ｈ６ＬＥ．合液加热至９，然后在内逐步缓慢冷却至室温。接着加入ｕ１—ｉｃｏｘ－ｌｉ连接酶（１Ｕ叫／）、４Ｕ［ｉＬｌ〇的连接酶反应缓冲溶液（３００ｍＭＴｒｉｓＨＣｌＨ，ｐ＋—ｉ８．０４０ｍＭＭＣｌ１０ｍＭＤＴＴ２６０ｉＭＮＡＤ５００ｉｍＬＢＳＡ）＾及４，和超，ｇ２，ｆＪｇ咕°°纯水于１６Ｃ下反应连接。１２ｈ后，将反应液置于６５Ｃ下２０ｍｉｎＷ灭活连接酶。然—１Ｉ后加入１咕核酸外切酶Ｉ（２０ＵｎＬ）Ｗ及１咕核酸外切酶ＩＩＩ（１００Ｕ叫／）－－．１６ 硕±学位论文°°链ＤＮＡ９０Ｃ下灭活２０在Ｃ下反应过夜Ｗ水解体系中的单链和双，最后两种酶在３７°ｍｉｎ。将得到的环形模板储存在４Ｃ冰箱待用。２．２３Ｓ１核酸酶的检测ｓＤＮＡ０ｎＭ）的Ｓ１核酶缓冲溶液与不同浓度的Ｓ１将１０叫＾含有（终浓度为４０°。％Ｃ５ｍｉｎＷ终止酶切反应。核酸酶在３７Ｃ下僻育３０ｍｉｎ，然后于下反应２．２．４滚环护増反应１２ＵＢｓｔＤＮＡｄＮＴＰｓ．将上述的酶切反应物与５〇〇ｎＭ，３００ｎＭ环形探针Ｗ及－８ｍＭｘ０ｍＭＴｒｉｓＨＣｌ．８１０ｉｌ的ＴｈｅｒｍｏＰｏｌ中（２，ｐＨ，聚合酪混合于１０［Ｌ缓冲溶液°〇－６５Ｃ下反应２ｈ１〇ｌｒｉｔｏｎＸ１００），然后将反应混合物在ＫＣ．／〇Ｔｌ０ｍＭＮＨ４）２Ｓ〇４，，（°民ＣＡ产物。后８０Ｃ热２０ｍｍＷ灭活酶，从而得到，升温至失活２ＩＩＩ辅助的循环放大．２．５巧酸外切酶ｘｍＭｂ－ＮＥＢ缓冲液ｉｓＴｒｉｓ将５ＴａＭａｎ探针、５＾ｌＬ１０ｌ（１００＾ｌＬ浓度为ｌ＾ｌＭ的ｑ，－０ｍ加入ＲＣＡ产物中于ＴＴＨ７．０２Ｕ的核ＨＣＩ１００ｍＭＤ．０）Ｗ及酸外切酶丙烧，，ｐ〇Ｃ避光反应９０。３７ｍｉｎ，然后进行巧光检测２．３结果与讨论２．３．１实验原理一是将Ｓ本章中Ｈ个关键设计；１核酸酶的底物链作为，该Ｓ１核酸酶传感器有艮ＣＡ反应的引物链；二是民ＣＡ放大反应；Ｈ是核酸外切酶ｍ辅助的循环放大庭应。原理如图２．１所示。Ｓ１核酸酶存在的情况下，ｓＤＮＡ被酶切成单个或小片段的脱氧此无法获得ＲＣＡ产物。后续的ＲＣＡ反应因缺乏引物链而无法进行，因核糖核巧酸，但当体系中不含有Ｓ１核酸酶时，ｓＤＮＡ将保持完整，并可Ｗ与环形ＤＮＡ模板互补杂一ＤＮＡ（图２．１Ａ）。然后，交从而引发ＲＣＡ反应得到条长的、含重复序列的单链Ａ产物互补的ＴａＭａｎ探针进行巧光分ＩＩＩ先设计的、与ＲＣｑ在Ｅｘｏ的帮助下，利用预析ＴａＭａｎ探针上的巧光报导基团和巧光萍灭基团距离较近，巧光被。起初，由于ｑ，可Ｗ被Ｅｘｏ一ＩＩＩ旦与ＲＣＡ产物杂交ａＭａｎ探针的３端变成凹陷状态，因而浑灭。，Ｔｑ’巧光报导基团从而产生巧光信号。与此同时，３端凸出的ＲＣＡ产酶切水解，释放（Ｍａｎ探针杂交，图Ｔａ，循环往复巧光信号大大増强物则免遭酶切，可继续与其它ｑ放大战略和酶切反应前后的巧光变化，我们设计了２．１Ｂ）。因此，利用这种双重一种灵敏且高效的。Ｓ１核酸庚巧光传感器－７－１ 基于滾环扩增和核酸外切酶ｍ辅助循环放大的高灵敏災化生物传感器研究ＡｃｉｒｃｕｌａｔｅｍｌａｔｅｐｎｏＲＣＡＰｒｏｄｕｃｔ＾「ｓＤＮＡＤＮＡｏｍｅｒａｓｅ八／Ｖ／ｐｌｙＲＣＡＰｒｏｄｕｃｔ＾Ｂ，：ＲＣＡＰｒｏｄｕｃｔ＾＼＿＿甚名ｄ＞图２．１ＳＩ核酸酶巧光传感器原理示意图：（Ａ）Ｓ１核酸酶存在与否下的ＲＣＡ反应；（Ｂ）ＥｘｏＩＩＩ辅助酶切循环巧光信号放大反应２．３．２传感器的验证为了证实设计思路行之有效，我们首先进行了癸光检测。激发波长为４９２ｎｍ时，并未检测到ＴａｑＭａｎ探针的巧光，这也就意味着体系的背景巧光非常小（图２．２Ａ）Ｓ１５２０（ａ。核酸酶时，巧光发射在ｎｍ处显著地増强英光，曲线当体系中没有一（．基团ＦＡＭ的特征峰），说明体系中产生了ＲＣＡ产物图２２Ａ曲线ｂ）。旦引入，Ｓ１核酸酶，巧光急剧下降，这表明ｓＮＤＡ被Ｓ１核酸酶水解，因而无法引发ＲＣＡ反应ＴａＭａｎ探针杂交的产物（图２．２ＡＣ）。来产生与ｑ，曲线为了确保萊光信号的减弱°１Ｓ１１０是由Ｓ核酸酶切导致，我们先将核酸酶在９５Ｃ下加热ｍｉｎ使酶发生不可逆的ｓ变性，再将灭活的Ｓ１核酸酶与ＤＮＡ赔育，最终的结果显示有很强的巧光信号产生１ＤＮＡ（图２．２Ａ曲线ｄ）所致。，由此证实了先前黄光降低确实是由Ｓ核酸酶水解ｓ，同时，我们还进行了凝胶电泳实验，电泳结果同样映证了芙光结果。图２．２Ｂ描述了在不同实验情况下Ｓ１核酸酶催化切除ｓＤＮＡ的琼脂糖凝胶电泳图。Ｓ１核酸酶存在的情况下，ｓＤＮＡ被水解成单个或小片段的脱氧核糖核酸从而可迁移出凝胶，在电泳芙光图谱上无法看到ｓＤＮＡ（孔２）的条带，在没有Ｓ１核酸酶存在时。相反的ｓＤＮＡ条带（孔１）Ｗ及与灭活的Ｓ１核酸酶脾育的ｓＤＮＡ条带（孔３）却清晰可见。这些结果表明，体系的荣光降低确实源于Ｓ１核酸酶对ｓＤＮＡ的降解。类似的结果也出现在ＲＣＡ反应产物的凝胶电泳图上（图２．２Ｃ）。孔２处并未看见民ＣＡ产物，这也ＲＣＡＮＡＷ及与灭Ｓ１核酸是因为ｓＤＮＡ被降解从而无法引发反应所致。但是，沁活酶解育的ｓＤＮＡ均能在ＲＣＡ反应中转变成高分子量的单链ＤＮＡ，从而分别在孔１和子Ｌ３的孔口处呈现明亮而清晰的条带。－－１８ 硕±学位论文Ａ饥００Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ？ｓＤＮＡ．＿－＿ｂ￣祀ＮＡ巧３４００口１＂＂＇＾＂＂＊、＇＊＊＊＊＊－＊＾－Ｉ＋ｄｅｎａ巧＾ｄ：，ＤＮＡｔｕｒｅｄＳ１＇■■Ｓ３０００＼Ｓ２０００占Ｊ１０００ｒ０■■５２０５４０５６０５８０６００Ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ（ｎｍ）ＲＭ１２３广Ｍ１２３■■５６＾■圍３０ｂ２．２（Ａ）Ｔａｍａｎｓ４００ｎＭＳｌ图ｑ探针的英光发射光谱图；所使用的ＤＮＡ终浓度为核酸酶的，－ＵｍＬｉ０２０．０２ＵｘｏＩＩＩ．Ｓ１终巧度为，体系中含有的Ｅ（Ｂ）核酸酶酶切反应的琼脂糖凝胶电泳图（５％），孔Ｍ：１０ｂｐ的Ｍａｒｋ，孔１：１０沁ＮＡ，孔２：１０ｓＤＮＡ和１ＵＳ１核：１１核酸巧２ｈ）酸巧，孔３１０ｎＭｓＤＮＡ和Ｕ巧活的Ｓ；（Ｃ）ＲＣＡ反应（的琼脂糖凝巧电泳田（０．７％）２．３．３实验条件优化一ｉ为了得到最佳的信号响应，我们进行了系列的实验Ｌ：，？得到最佳检测条件其中包括Ｓ１核酸酶催化水解ｓＤＮＡ的时间、ＲＣＡ反应的各种条件（如ＲＣＡ反应时间、聚合酶的浓度、环形模板的浓度Ｗ及ｄＮＴＰ的浓度）和ＥｘｏＩＩＩ辅助循环放大的反应条件（如ＴａＭａｎ、ＥｘｏＩＩＩ的浓度及其酶切时间）２．３Ｓ１ｑ探针的浓度。图反映／核酸１酶酶切时间对荣光强度的影响，Ｆ和Ｆ分别代表不存在和存在Ｓ核酸酶时的英光强ｄ１度，，，５ｍｉｎ，。由图可知随着反应时间的延长英光信号减小在前内巧光强度快速降低，而３０ｍｉｎ后巧光强度几乎不再发生变化。这说明ｓＤＮＡ在３０ｍｉｎ内基本上－９－１ 盡于滚环扩增和核酸外切酶川辅助巧环放大的高灵敏义光生物巧感器研光，３０ｍｉｎ作为Ｓ全部被水解完全。因此选择１核酸酶催化水解反应时间。１００８０２〇６０／４０雹／＾２０Ｉ——————０■■■■■—０１０２０３０４０５０６０Ｓ１ｎｕｃｌｅａｓｅｃｌｅａｖａｇｅｔｉｍｅ（ｍｉｎ）２ＩＴＭＩ图．３Ｓａｑａｎ探针黄光响Ｉ应的影响Ｓ核酸巧巧切反应时间对；核酸巧和ｓＤＮＡ的终巧度｜分别为０．０２Ｕ０／和４００ｎＭ。误差棒是３次平行实验的标准偏差＾由于ＲＣＡ产物中存在大量与ＴａｑＭａｎ探针互补的重复碱基序列，因此艮ＣＡ反应时间直接影响ＥｘｏＩＩＩ辅助的巧光信号放大。图２．４讨论了ＲＣＡ反应时间对英光信号的影响，，。由图可知传感器的巧光信号随民ＣＡ反应时间的巧长而増大两个小时后，巧光强度増加很缓慢，预示着民ＣＡ反应几乎反应完全，而此时的信噪比最高，因此选择２ｈ作为民ＣＡ反应的最优时间。同理，黄光信号的强度也会随着民ＣＡ反应体系中聚合酶的浓度、环形模板的浓度Ｗ及ｄＮＴＰ的浓度增大而增强，但背景信号也会随之増加，因此选择信噪比最島时对应的浓度作为最佳反应条件，—＇它们分别是５．Ｍ：终浓度为２０ＵｍＬ的ＢｓｔＤＮＡ聚合酶（图２．），终浓度为０５ｍＮＴＰ（．６）３００ｎＭ的２的ｄ图２Ｗ及终浓度为环形模板（图．７）。５０００９ｗａｒｎｎｏｓｉ—■０．０４ｕｎ化ＳＩｔ一誦芝；０．５１２３３．５４ＲＣＡＴｉｍｅｈ（）图２．４ＲＣＡ反应时间对传感器巧光信号的影响。误差棒是３次平行实验的标准偏差－２０－ 硕±学位论文—１２４００００．０４ｕｎｉｔＳ１＾Ｉ！輪邮０５１０２０３０４０５０６０Ｃ＿１ｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆ巳Ｓｔｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＵｍＬ）图２．５聚合酶浓度对传感器巧光信号的影响３次。误差棒是平行实验的标准偏差５０００化ｒ＾ＨｎｏＳｉ？０．０４ｕｎｉｔｓＳＩ４０００化史Ｎ扁＞０．０５０．１０．３０．５０．８１２。３图．６ｄＮＴＰ浓度对传感器巧光信号的影响误差棒是次平行实验的标准偏差３０００１０■■ｎｏＳ１下？００４ｕｒａＨＳ１．４３２５００—，＇ＭｄｒＸＡ９＾２〇〇〇８ｉｚ叫ｍｉｌｌ；１００２００３００４００５００ＣｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆｃｉｒｃｕｌａｒｔｅｍｐｌａｔｅｎＭ（》。图２．７环形模板的浓度对传感器巧光信号的影晌误差棒是３次平行实验的标准偏差－２－１ 基于滚环扩增和核酸外切酶出辅助巧环放大的島灵敏巧光生物化感器研究Ｅｘｏ一’’’ＩＩＩ是种从３端到５端定向水解双链ＤＮＡ的脱氧核糖核酸酶３，对端’平齐或凹陷的双链ＤＮＡ有特异性响应，对３端凸出的双链Ｗ及单链ＤＮＡ没有活ＰＷ性。但是，我们小沮发现高浓度的ＥｘｏＩＩＩ也可缓慢水解单链ＤＮＡ，这意味着高浓度的ＥｘｏＩＩＩ将致使高的背景信号，但是ＥｘｏＩＩＩ浓度过低，使传感器不灵敏，，ＥＩＩＩ因此ｘｏ的用量对传感器至关重要。图２．８考察了ＥｘｏＩＩＩ浓度对传感器响应信号的影响。起初，传感器的英光信号随着ＥｘｏＩＩＩ量的增加而增大，然后在高浓Ｅｘｏ一一度的ＩＩＩ下信号出现波动，但是背景信号却直随么迅速增大，这也再次证实高浓度的ＥｘｏＩＩＩ能够酶切水解单链ＴａｑＭａｎ探针。由图可知，信噪比在Ｅｘｏｍ－＇终浓度为０．４ＵｍＬ时达到最大，高于或者低于该值信噪比均不是最佳，因此将该浓度作为传感器的最佳酶用量。５０００２０■■ＢａｃｋｒｏｕｎｄＡｇＱ■〇３４００ｎＭｓＤＮＡ．Ｔ４０００ＴＴ．女１６３。。。’雪Ｉ！ｕ６！１０００］＾ｍｉｎｔ〇０２０．４．１２４－１ＥｘｏＩＩＩＵｍＬ（）图２．８ＥｘｏＩＩＩ的巧度对传感器巧光信号的影响。误差棒是３次平行实验的标准偏差同样，ＴａｑＭａｎ探针的浓度和ＥｘｏＩＩＩ酶切反应时间对传感器信号有着类似的影响，ＴａｑＭａｎ探针浓度越高、酶切反应时间越长，巧光信号和背景信号均不同程度的增加，因此，选择信噪比最佳时的反应变量Ｍａｎ，也就是终浓度为ｌＯＯｎＭ的Ｔａｑ探针（图２．９）和９０ｍｉｎ的酶切反应时间（图２．１０）作为ＥｘｏＩＩＩ辅助循环放大的最佳反应条件。６０００Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ１６＾４００ｎＭＮＡｔＯ了＾＾．１４３５０００．．謹足．ｒＴ两１２＞４０００？ｔＺ。湧３。。〇．｜：；ｉ＝２０００護ｎ６国謂＾４ｉｌ！１０００５０１００２００３００５００ＣｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆＦＰｎＭ（）图２．９ＴａｑＭａｎ探针（ＦＰ）的浓度对传感器黄光信号的影响。误差棒是３次平行实验的标准偏差－２２－ 硕±学位论文．１６圓气４０００■ＸＸ：２０。。．｜ｆＩＭｒ！Ｉ｜＇ｙｒ？６Ｉ４二１０００！ＬＬ．．Ｈ．２．＿０１１？￣￣ｍｍ＿ｍ＿ｉ〇３０６０９０１２０１如ＥｘｏＩＩＩｃｌｅａｖａｇｅｔｉｍｅｍｉｎ（）图２．１０ＥｘｏＩＩＩ酶切反应时间对传感器巧光信号的影响。误差棒是３次平行实验的标准偏差２３４Ｓ１．．核酸酶的检测分析，该检测方法对Ｓ在优化的实验条件下１核酸酶的线性检测区间和最低检测浓度被考察，我们用不同浓度的Ｓ１核酸酶与ｓＤＮＡ进行赔育从而得到传感器的英光７－ｌ２１１Ａｘｘ变化情况。从图２．，随着Ｓ５ｌ（ｒｌ／１０可Ｗ看出１核酸酶浓度从Ｕ＾增加到２ｉＩＵ＾／，所检测到的芙光强度呈逐渐下降趋势，表明ｓＤＮＡ水解程度加剧。图２．１１８描绘了传感器巧光信号与不同Ｓ１核酸酶浓度的关系，由图可知，当Ｓ１核酸酶浓－２－ｌ度达到２ｘｌＯＵ＾＾Ｌ时，英光信号强度降至平台，且芙光强度在８１核酸酶浓度处￣５３ｌ于５ｘ１（ＴＵ１．５ｘｌ（＾ＵｌＬ范围时，呈现良好的线性关系，相关系数为叫到＾一些其它检测Ｓ０。２１核酸酶的方法，相比之下．９９７表２．总结了，我们的方法表现出更高的灵敏度。－２３－ 基于滚环扩巧和核酸外切贿ｍ辅助巧环放大的高灵敏巧光生物巧感器研究Ａ如００—。？－＾—００．＿＿００５＿４０００迪二Ｌ罩，’‘｜＂ｕ曲’３０００－：＾＾＾Ｅ＾Ｉ＾ｐ＾２０００．Ｉ：＾＾＾Ｉｔｕｔ１０００￣￣￣０班０５４０５６０５８０６００—Ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈｎｍ（）Ｄ５０００－Ｉ１ｉ三３５００Ｉ■ＩＩ：１４０００？立；Ｋ立２５００＾－－３０００扣饥５５Ｃ＼Ｉ１５００ｇＷＭ２０００■ｇ姜＼１ｉＥｉｓｏｏ－ＬＬ１００００．００＾０．４０．６０．８１．０１．２１．４１．６、－３＿ｉＳ１Ｘ１〇ＵｍＬ［］（）０■ｒｒ■■：：０２４６８１０１２１４１６１８２０２２３－１＾１ｘ１〇ｕｍＬ］（）２１Ａ）图．１（对不同巧度的ＳＩ核酸酶检测的巧光发射光谱图。（Ｂ）费光信号强度与ＳＩ核酸Ｓ１３酶浓度的关系。插图为核酸酶检测的线性响应范围。误差棒是次平行实验的标准偏差表２．２本传感器与其它Ｓ１核酸酿检测方法的比较检测限方法借助王具参考文献１１（Ｕ）心４电化学聚阳离子敏感的膜电极２．４Ｘｌ（Ｔ［８１］－３ｘ巧光嘻咯的凝集诱导发射７．５１０［８３］５９Ｘ歌光二蔡嵌苯衍生物的凝集诱导泮灭１（Ｔ４．２巧］－３比色带正电的金纳米颗粒４．３ｘ１０６巧］４巧光Ｗ单链ＤＮＡ为合成模板的铜纳米颗粒３．０Ｘ１（Ｔ９０［］５Ｇ１０Ｘ巧光接近富碱基序列后巧光增强的银纳米簇．１（Ｔ９３［］—５策光Ｇ－四联体和原叶晰ＬＸ４ｘ１０９７．０［］－７ＲＣＡＥＩＩＩ５ｘ荣光ｘｏ．０１，辅助的循环放大０本工作－２４－ 硕±学位论文２．３．５选择性考察Ｓ一为了验证该传感器检测１核酸酶的选择性和特异性，我们选用了些常见的ＩＩＩＩ）酶和蛋白作为干扰物进行对照实验，其中包括核酸外切酶（ＥｘｏＩＩ、牛血清蛋白（ＢＳＡ）、凝血酶Ｔｈｒｏｍｂｉｎ）ｃｈＥ）。结２．１２（Ｗ及乙醜胆碱醋酶（Ａ果如图所示，虽然各种干扰物质的浓度远远高于Ｓ１核酸酶，但仅在Ｓ１核酸酶存在的时传感器才有很好的信号响应，其它的酶或蛋白在同样相同实验条件下，焚光信号变化很小。这说明该传感器对Ｓ１核酸酶的检测具有良好的选择性。５０００－Ｉ１ｎｉｌ２。。。．ＩＩＩ｜ＩＩＢｌａｎｋＳ１Ｅｘｏ川ＢＳＡＴｈｒｏｍｂｉｎＡｃｈＥｉ图２．１２ＳＩ核酸酶检测的选择性考察。ＳＩ核酸酶的浓度为２０ＵｍＬ，核酸外切酪ＩＩＩ的浓度－－－ｉｉｉ为５０ＵｍＬ，ＢＳＡ的浓度为ＩｍｇｍＬ，凝血酶和乙醜胆碱醋酶的巧度为５００ＵｍＬ。误差棒是３次平行实验的标准偏差２．３．６实际样品分析为了验证该巧光传感器在生物样品中对Ｓ１核酸酶进巧检测的可行性，我们选用了ＨｅＬａ细胞的裂解液作为样品Ｗ检测其中的Ｓ１核酸酶。ＨｅＬａ细胞中Ｓ１核酸，酶含量分析结果如表２，得到的回收率Ｗ．３所示。此外我们进行掠准添加法实验及相对标准偏差都比较令人满意，表明该方法可Ｗ尝试应用于实际样品中Ｓ１核酸酶的检测。表２．３ＨｅＬａ细胞中Ｓ１核酸巧的检测检测值添加值添加后的分析值样品回收率（％）ＲＳＤ（％），，，＇＇Ｕ＇ＵｍＬＵｍＬｍＬ１０．２２０．５００．７１９８．６３．３２０．５８０．５０１．１１１０２．８６．６３０．９５０．５０１．４６１００．７４．４样品３为原始的ＨｅＬａ细胞巧解液，样品１和样品２分别是在样品３的基础ｈ分别稀释Ｔ４倍和１倍。－２５－ 基于滚环扩增和核酸外切巧山辅助循环放大的髙灵敏巧光生物传感器研巧２．４小结一本章基于滚环扩増和核酸外切酶ＩＩＩ辅助循环的双重放大，构建了种超灵敏的核酸酶检测方法。该方法直接将Ｓ１核酸酶的底物ＤＮＡ设计为ＲＣＡ反应的引物链，在ＲＣＡ反应中扩増成可与ＴａＭａｎ探针互补的、由重复序列串联的大分子单ｑ链ＤＮＡ，再通过ＥｘｏＩＩＩ循环酶切产生可检测的巧光信号，两次放大使这种检测方法十分灵敏和可靠。ＲＣＡ的引物链即为Ｓ１核酸酶作用的底物链，避免了繁琐的ＤＮＡ链设计Ｗ及链替代反应，整个实验无需复杂的温度循环仪器，操作简便。此夕ｈ该方法还用于实际样品分析中，并且表现优良。基于上述优点，本章构建的这种超灵敏的费光传感器有望在生物医学、生物学和生物传感等领域得到更广泛的应用。－２６－ 硕±学位论文第３章基于滚环扩增桥连的两次核酸外切酶ＩＩＩ辅助循环的多重放大黄光传感器用于ｍｉｃｒｏＲＮＡ的超吴敏检测３．１前言一ｃｒｏ８？ＭｉＲＮＡ是类短小的、内源性的非编码ＲＮＡ，长度大约在１２４个核糖核昔酸之间。它们在生理和病理过程中扮演重要的角色，，可Ｗ调控基因的活性９８￣ｉ０２ｌｔ、、且对细胞的増殖迁移Ｗ及调ｔ有抑制或促进作用，在癌症糖尿病和阿尔ｉＭｉ’ｔＷ兹海默症的诊断和预后中也十分有预测价值。有研究发现，某些ｍｉｃｒｏＲＮＡ能够在癌细胞中异常表达，这种表这与癌症启动、肿瘤阶段Ｗ及对肿瘤治疗的响１０２１０５１１，：应息息相关。所（＾｜，ｍｉｃｒｏＲＮＡ被当作癌症治疗中的肿瘤标记物和治疗範标－９８ｗｉｉＭｉ，［，Ｗ。ｍｉ因此，ｃｒｏＲＮＡ的高效检测对更好地了解它们在肿瘤细胞中的角色一Ｗ及进步验证其在生物医学研巧和临床诊断中的功能至关重要。但是，ｍｉｃｒｏ一民ＮＡ的一些特殊性质使分析它们具有定的难度，例如，片段小、在家族中序列ｉ的高同源性ｔＷｍｃｏＡ、在总体ＲＮＡ中的低丰度。因此，发展持异性、超灵敏的ｉｒＲＮ定量检测的方法乃当务之急。Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印记分析法是现行的ｍｉｃｒｏ艮ＮＡ标准检测法，但是这种方法需要的ｉＡｉＷｔ样品量较大，且灵敏性不太令人满意。微阵列也因为其高通量的筛选能为被越来越多地用到ｍｉｃｒｏＲＮＡ的表达分析中，尽管如此，其灵敏度和特异性仍然有－ｍ１１６［］待提商。实时ＰＣＲ也被经常用于ｍｉｃｒｏＲＮＡ分析，其检测限可达到单分子水平，但是，该方法需要精准地控制温度循环Ｗ保证放大过程的成功，而且因ｍｉｃｒｏｉｉｗｗｔＲＮＡ片段小，需要比较复杂的链设计。除上述常用的检测方法，许多新策略被研究Ｗ改善ｍｉｃｒｏＲＮＡ分析的灵敏性和稳定性，如基于纳米粒子的分析ＵＭ１２５ｉｔＷ［］［Ｗ，基于生物发光的方法，改进的浸染检测法，基于核糖核酸酶的方法ｉｎＩｉｗｌｉＩＷｆｉ，基于序列设计的方法，ＤＮＡ链替换法，基于发夹的放大法及基ｕｗｕｆｉ等于聚合物交联的方法。滚环扩増因其具有简单、稳健、特异、高灵敏、等ｗｏｎｔｉ温放大的特点被越来越多地应于ｍｉｃｒｏＲＮＡ的检测中Ｊｓｔｒ叩等首次一借助滚环扩増（ＲＣＡ）构建了个ｍｉｃｒｏＲＮＡ的分析平台，该平台使用ｎｏｒｔｈｅｒｎ＂４ｅｎ［１印记法作为检测方法。Ｃｈｇ等通过引入二级引物而非待检测的ｍｉｃｒｏＲＮＡ作）为挂锁探针的连接模板，再将ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩ（ＳＧ原位插入艮ＣＡ产物中进行巧光检测。此外，大量基于ＲＣＡ的改进方法相继被报道，如使用哑铃形的ＤＮＡ探ｉｉｔＷｔＷ针、脱氧核酶、编码的凝胶微粒等检测ｍｉｃｒｏＲＮＡ。本文构建了一种基于滚环扩增和两次核酸外切酶ＩＩＩ（ＥｘｏＩＩＩ）循环放大的多－２７－ 基于滚环扩增和核酸外切酶ｍ辅助循环放大的高灵敏巧光生物传感器研宛重放大黃光传感平台Ｗ灵敏地检测ｍｉｃｒｏＲＮＡ，按照ＥｘｏＩＩＩ酶切循环，民ＣＡ，＆Ｃ０一ＩＩＩ酶切循环的顺序进行Ｈ次信号放大。首先设计了种用于识别目标ｍｉｃｒｏＲＮＡＡ该发夹ＤＮＡ茎部的’的发夹ＤＮ，３端凸出且能与範标大部分互补杂交，当体系中存在目标ｍｉｃｒｏＲＮＡ时，它将与发夹ＤＮＡ杂交，从而打开发夹形成原发夹ＤＮＡ’的’３端平齐的双链结构，此时Ｅｘｏｍ将从原发夹链的３平齐端开始水解双链部分，’’目标物则因为其３端序列未完全与发夹ＤＮＡ序列互补形成凸出的３端而免遭酶ＤＮＡ一切，被释放并重新打开其它发夹，进巧第次信号放大。同时被释放的还有发夹ＤＮＡ中与ｍｉｃｒｏＲＮＡ不互补的部分，该部分被设计成为ＲＣＡ反应中的引物链，可与环形ＤＮＡ模板杂交，在适当反应条件下，引发民ＣＡ反应，生成民ＣＡ产物，进行第二次信号放大。得到的ＲＣＡ产物可与单链ＴａＭａｎ探针互补杂交，使ｑ’ＭＴａｑＭａｎ探针形成凹陷的３端，进而被ＥｘｏＩＩＩ水解，使Ｔａｑａｎ链上的费光基团与萍灭基团分开，焚光信号被检测。同时ＲＣＡ产物可重新与其它的ＴａｑＭａｎ探针继续杂交，ＥｘｏＩＩＩ绝续酶切，释放更多的巧光基团，进行第Ｈ次信号放大。本章基于上述原理，实现对ｍｃｒｏＲＮＡ。ｉ超灵敏地定量检测３．２实验部分３．２．１试剂和仪器本章中使用的所有脱氧核糖核昔酸链均由上海生工生物工程股份有限公司合３１）Ｈ化ＣＲＮＡ由Ｔａｋ１成（序列见表．，并且都经过纯化，ｍｉｃｒｏａｒａｂｉｏ；ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（大连）公司合成纯化得到，核酸外切酶ＩＩＩ、ＢｓｔＤＮＡ聚合酶（大片段）、Ｅ．ｃｏｌｉＤＮＡ连接酶、脱氧核糖核巧酸混合液（做ＴＰｓ）Ｗ及ＢＳＡ均从ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ（Ｉｐｓｗｋｈ，ＭＡ，ＵＳＡ）购买。其他所有试剂均为分析纯，从上海国药集团化学试剂有限公司获得。所有的试剂均用由ＤＥＰＣ（焦碳酸二己醋）处理过的去离子水配制（从上海生工生物工程股份有限公司购买）。－英光检测仪器为Ｆ７０００英光分光光度计（Ｈｉ化化ｉＪａａｎ），Ｔａｍａｎ探针的，ｐｑ激发波长为４９２ｎ－６００ｎｍｃｍｉｎ，巧光发射光谱扫描范围为５１０ｌ的标准石英比色，皿ｎｍ，检测电压为９。，激发光和发射光的狭缝宽度均为５．０５０Ｖ－２８－ 硕±学位论文表３．１本实验中所使用的ＤＮＡ序列信息，，？序列一（５３）Ｌｅ－ＡＧＧｔ７ａＵＧＡＧＧＵＡＧＵＵＵＧＵＡＵＡＧＵＵＧＴＡＧＧＴＴＧＴＡＧＧＡＧＧＡＧＡＡＴＴＧＧＧＴＡＣＡＡＣＣＴＡ发夹ＤＮＡ（ＨＰ）ＣＴＡＣＣＴＣＡＰＯ－ＣＣＴＡＣＡＡＣＣＴＡＣＡＡＡＣＣＴＣＧＡＣＴＧＣＡＡＧＣＴ３挂锁探针ＣＴＣＣＧＡＣＣＴＡＣＣＣＡＣＣＡＣＣＣＡＡＴＴＣＴＣＣＴ－ＴａｑＭａｎ探针（ＦＰ）ＣＧＡＣＣＴ（ＴＡＭＲＡ）ＡＣＣＣＦＡＭ－Ｌｅｔ７ｉＵＧＡＧＧＵＡＧＵＡＧＵＵＵＧＵＧＣＵＧＵＵ－ｍｉＲ２２２ＡＧＣＵＡＣＡＵＣＵＧＧＣＵＡＣＵＧＧＧＵＣＵＣ－２２３ＵＧＵｍｉ民ＣＡＧＵＵＵＧＵＣＡＡＡＵＡＣＣＣＣＡ３．２．２环形探针的制备５ｘ的杂交缓冲液－将６［ｉＬ（１５０ｍＭＴｒｉｓＨＣｌＨ８．０，５００ｍＭＮａＣｌ２０ｍＭ，ｐ，ＭＣｋ）８（ｌＯｍＭ）Ｗ及１０（ｓＤＮＡ）ｇ，＾Ｌ挂锁探针叫连接探针混合，并将混°合液加热至９５Ｃ保持１０ｍｉｎ，然后在３ｈ内逐步缓慢冷却至室湿。接着加入６ｊｘＬ’－ｉ１＞＜－Ｅ．ｃｏｌｉ连接酶（１Ｕ咕）、４ＵｉＬ１０的连接酶反应缓冲溶液（３００ｍＭＴｒｉｓＨＣｌ＾，＋—ｉｐＨ８．０，４０ｍＭＭｇＣｂ，１０ｍＭＤＴＴ，２６０ＮＡＤ和５００帖ｍＬＢＳＡ）抖及４ｎＬ°°５超纯水于１６Ｃ下反应连接。１２ｈ后，将反应液置于６Ｃ下２０ｍｉｎＷ灭活连接—１酶。然后加入１咕核酸外切酶Ｉ（２０Ｕ咕）Ｗ及ｌ＾Ｌ核酸外切酶ＩＩＩ（Ｉ００Ｕ１°°叫／）在３７Ｃ下反应过夜将单链和双链ＤＮＡ切除，最后两种酶在９０Ｃ下灭°活２０ｍｉｎ。将得到的环形模板储存在４Ｃ冰箱待用。３．３ｍｍｉｃｒｏＲＮＡ．２核酸外切酶辅助的目标循环放大３０ｍＭＴｒｓ－ｍＭＮａＣ将２０阵反应缓冲溶液（ｉＨＣｌＨ８．０１００ｌ４ｍＭ，ｐ，，Ｃｋ－Ｍｇ），１０ｉＬ发夹ＤＮＡ，１０＾不同浓度的ｌｅｔ７ａ＾及４Ｕ的核酸外切酶ＩＩＩ＾。°混匀后于巧Ｃ下賠育１ｈ，然后于８５Ｃ下反应１０ｍｉｎ灭活酶从而终止酶切反应。３．４．２滚环扩増反应将上述的酶切反应产物与５００［ｉＭｄＮＴＰｓ，３００ｎＭ环形探针＾及１．２ＵＢｓｔｅｒｍｏＰｏ（ｒ－ＤＮＡ聚合巧混合于１０＾的Ｔｈｌ缓冲溶液中２０ｍＭＴｉｓＨＣｌＨ８．８，冲，ｐ°１ｍＭ（ＮＨｒｏｎ－０ｍＭＫＣｌ１０ＳＯ０，４）２４．１％ＴｉｔＸ１００）然后将反应混合物在６５Ｃ，，°下反应２ｈ后，升温至８０Ｃ热失活２０ｍｉｎＷ灭活巧，从而得到ＲＣＡ产物。－２９－ 基于滚环扩増和核酸外切酶【ＩＩ辅助循环放大的高灵敏巧光生物传感器研究３．２．５核酸外切酶ｍ辅助的黄光信号放大将５＾Ｌ浓度为ａｘｓｓ－ｌ＾ｌＭ的ＴｑＭａｎ探针、５＾ｌＬ１０ＮＥＢ缓冲液ｌ（１００ｍＭｂｉＴｒｉ－ｍＭＨＣ．．，丙焼１，１００ＤＴＴ，ｐＨ７０）及００２Ｕ的核酸外切酶ＩＩＩ加入ＲＣＡ产物中°Ｃ避光反应９０ｍｉｎ。于３７，然后进行蒙光检测３．３结果与讨论３．３．１实验原理Ｈ次放大一本章对ｍｉｃｒｏＲＮＡ的检测进行了；第次是核酸外切酶ＩＩＩ酶切发夹ＤＮＡ，从而实现目标物的循环放大；第二次是ＲＣＡ放大反应；第Ｈ次是核酸外切一酶ＩＩＩ酶切ＴａｑＭａｎ探针，从而使巧光信号放大。原理如图３．１。首先设计种发夹ＤＮＡ，该发夹ＤＮＡ绿色部分的序列与目标ｍｉｃｒｏＲＮＡ的大部分序列互补，蓝色部分的序列与ＲＣＡ反应中的环形ＤＮＡ模板互补。起初，由于发夹ＤＮＡ茎上的’３端西出，因此可在含ＥｘｏＩＩＩ的体系中不被水解而稳定存在。当体系中有目标ｍｉｃｒｏＲＮＡ时，ｍｉｃｒｏＲＮＡ与发夹ＤＮＡ链互补杂交后形成的双链结构较发夹结构’’更为稳定，因此发夹被打开，形成原发夹ＤＮＡ的３端平齐、ｍｉｃｒｏＲＮＡ的３端凸’出的双链结构，此时ＥｘｏＩＩＩ将从原发夹链的３平齐端开始水解绿色部分，目标’ｍｉｃｒｏＲＮＡ则因其凸出的３端而免遭酶切，从而被释放并重新打开其它发夹ＤＮＡ，如此往复一，进行第次信号放大。同时被释放的还有发夹ＤＮＡ中的藍色部分，该部分则与环形ＤＮＡ模板杂交引发ＲＣＡ反应，得到民ＣＡ产物，进行第二次信号放ＭＭ’大。生成的ＲＣＡ产物可与单链Ｔａｑａｎ探针互补杂交，使Ｔａｑａｎ探针的３端凹略，进而被ＥｘｏＩＩＩ水解，ＴａｑＭａｎ链上的英光基团与萍灭基团分开，产生巧光信号。同时ＲＣＡ产物可重新与其它的ＴａｑＭａｎ探针继续杂交，ＥｘｏＩＩＩ继续酶切，释，巧光信号大大增强放更多的巧光基团，循环往复，进行第Ｈ次信号放大。反之，当不存在目标ｍｉｃｒｏＲＮＡ时，发夹不能被打开，ＲＣＡ反应的引物链不会被释放，。从而检测不到巧光信号因此，利用这种ＲＣＡ巧连的两次核酸外切酶ＩＩＩ循环的一（ＥｘｏＩＩＩ－ＲＣＡ－Ｅｘｏ多重放大战略ＩＩＩ），我们设计了种高效且超级灵敏的ｍｉｃｒｏＲＮＡ蒙光传感器。－３０－ 硕±学位论文ＨａｉｉｒｐｎＤＮＡ｝——＊＾＾３严？．３ｍｉｃｒｏＲＮＡｓＸＥｘｏＤ？－＼—）＾？－Ｊ‘１‘〇＼ｔｃｉａｔ？ｔＳｒｃｕｌｒｍｐｌａｔ；ｇ＂ｑ…＂ｍｂ，ＲＣＡＰｒｏｄｕｃｔ，＾＾＾礙７ＶＪ＊－－－４違系３－－．１ｘｏＩＩＩＲＣＡＥｘｏＩＩＩｍＲＮＡ图基于Ｅ的多重放大巧光传感器用于检测ｉｃｒｏ的原理图３．３．２传感器的验证，３２我们首先对其可行性进行验证．依据传感器设计原理。图为反应体系的茨光光谱图。曲线ａ表示体系中仅存在ＴａｑＭａｎ探针时的光谱图，在激发波长为４９２ｎｍ时，并未检测到蒙光，这说明背景英光非常小。曲线ｂ为不存在目标ｍｉｃｒｏ艮ＮＡ时，体系的巧光光谱图。由于此时发夹ＤＮＡ没有目标物将其打开，ＥｘｏＩＩＩ不能将其水解，致使引发ＲＣＡ反应的引物链无法被释放，ＲＣＡ因此不发生反应，也不会发生后续的ＥｘｏＩＩＩ水解ＴａｑＭａｎ探针释放巧光基团的反应，所Ｗ检测不到巧光Ｃ－信号。曲线表示当体系中引入靴标ｌｅｔ７ａ时的巧光光谱图，可看到很强的巧光－信号。这是因为ｌｅｔ７ａ与发夹ＤＮＡ互补杂交后形成的巧链区域被ＥｘｏＩＩＩ水解后，释放出的引物链引发了ＲＣＡ反应，得到的ＲＣＡ产物与ＴａｑＭａｎ探针杂交形成单链双链区串联的结构，此时体系中的Ｅｘｏｍ可Ｗ水解双链民域的ＴａｑＭａｎ探针，－将巧光报导基团释放出来，发射出巧光，。曲线ｄ与曲线Ｃ相比较其区别在于ｌｅｔ７ａ，和发夹探针杂交后没有在体系中引入Ｅｘｏ，从而没有释放ＲＣＡ反应所需的引ＩＩＩ物链，因此后续的ＲＣＡ反应和ＥｘｏＩＩＩ酶切循环放大反应无法发生，致使巧光信■号不能产生。上述现象表明该传感器ＰＪ用于ｍｉｃｒｏ艮ＮＡ的检测。有趣的是，Ｘｕｅｔｗｉｌ等报道了即使不存在ＥｘｏＩＩＩ也可引发ＲＣＡ反应，这是因为他们在ＲＣＡ反应中使用的聚合酶为ｐｈｉ２９ＤＮＡ聚合酶，该酶不仅具有链替代活性，还具有链水解活性，在发夹ＤＮＡ与靴标杂交后，引物链序列部分是裸露存在的，它仍可退火到ＲＣＡ反应中的环形模’板上，此时ｐｈｉ２９ＤＮＡ聚合酶Ｗ将３末端不互补的部分水解－３＾ 基于滚环扩增和核酸外切酶川辅助循环放大的高灵敏巧光生物传感器研究后再延伸，引发ＲＣＡ反应。因此，本章中ＲＣＡ反应使用的聚合酶为不具有链水解活性的ＢｓｔＤＮＡ聚合酶，Ｗ保持传感器的稳定性。加００一＾ＴａｑＭ？口＇Ｉ■■ｂＨ尸＋ＥｘｏＩＩ＋ＲＣＡ巧ＸＯ＂＋ＴＳａｑ＂ａｎ－＋ＥｘｏＬＭ７ａ＋ＨＰｌ＂＋ＲＣＡ＋Ｅｘｏ＋？ｌｌＴＭａｎ巧４０００■ｑｄ－＋ＨＰ＊ＲＣＡ＊：Ｌ＂７ａＥｘｏｏ。。＂ＫＴｑ＂录３■＼０００＼２０００ｖＪａ！■．１０００＊■０Ｊ５２０５４０５６０５８０６００Ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ（ｎｍ）Ｍ－图３．２：所使用的发夹ＤＮＡ（ＨＰ）ｌＯＯｎ终浓度为，ｌｅｔ７ａ的浓度为ＯＭ，黄光响应分析ｌｐ两次放大过程中使用的ＥｘｏＩＩＩ的含量均为０．０２Ｕ３．３．３实验条件的优化为了使传感器法到最佳检测效率一，系列的实验条件被优化。因为发夹ＤＮＡ的用量对ｍｉｃｒｏＲＮＡ的检测十分重要，先对其浓度进行了优化。图３３．反映了发ＤＮＡ（ＨａｉｒｉｎＨＰ）对巧光强度的－夹ｐ，ＦＦ分ｅｔ，影响〇和别代表不存在和存在目标ｌ７ａ时检测到的巧光强度，ＤＮＡ的。由图可知随着发夹浓度增加，焚光信号增强，当浓度达到１００ｎＭ时，ＤＮＡ的，羡光强度达到平台浓度继续增加发夹，笑光信号也不再增加。因此，我们最终选择１００ｎＭ为传感器中发夹ＤＮＡ的终浓度。４５００４０００＿＿Ｉ３５００＊－４３０００■ｕ＿Ｘ２５００ｙ２０００ｒ１１Ｉ１５００１１１１０２０４０６０８０１００１２０１４０１６０ＣｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆＨＰｒｏｂｅｎＭｐ（）－３．３发夹ＤＮＡ的浓度优化。ｅ７ａ１Ｍ图ｌｔ的浓度为０误差棒是３次平行实验的标准偏差ｐ，－３２－ 硕±学位论文ＥｘｏＩＩＩ在整个传感器中的作用尤为重要，因此对其反应浓度和反应时间进行’优化十分必要，Ｅｘｏｉｎ。由上章可知高浓度的可Ｗ水解单链或者３端凸出的双链ＤＮＡ一，在ＥｘｏＩＩＩ辅助的第次循环放大过程中，ＥｘｏＩＩＩ的浓度过高将出现假阳性，浓度过低又使传感器不够灵敏，ＩＩＩ．因此，先的用量进行了优化４对Ｅｘｏ。图３一Ｅｘｏ考察了第ＩＩＩ浓度对传感器响应信号的影响次循环放大过程中。传感器的巧光信号随着ＥｘｏＩＩＩ量的增加而增大，然后在高浓度的Ｅｘｏｎｉ下信号几乎不再变化，体系中不存祀标时的背景信号在低浓度的Ｅｘｏｍ时几乎没有增长，可是当浓度过一了某阀值，发夹ＤＮＡ被高浓度的ＥｘｏＩＩＩ水解释放出ＲＣＡ的引物链后，即使是少量的引物链，，经过ＲＣＡ放大后也会产生很强的巧光导致假阳性信号。由图可－ＥｘｏｉＩＩＩ０５ＵｍＬ知，在阔值之前，信噪比在终浓度为．时达到最大，因此将该浓一度作为传感器ＥｘｏＩＩＩ辅助的第次循环放大过程中的最佳酶用量。５０００１２Ｐ１０Ｍ－７？ｌｅｔｐ３欄．ｉｎ０ＴＴ１；３。。。尸Ｔ雪＼２〇〇〇｜，Ｉ．４！Ｉ｜－１０００１１１２０Ｌ，＋Ｖ，—＊ＩＩＩ頭■ｔ＿［００１０．．．２０．３０４０５０．６１２４．＿１ＣｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆＥｘｏＩＩＩＵｍＬ（）一ｘｏ图３．４第次放大过程中ＥＩＩＩ的浓度对传感器黄光信号的影晌。误差棒是３次平行实验的标准偏差一接着，我们第次循环放大过程中ＥｘｏＩＩＩ酶切的时间对传感器响应信号的影响，如图３，．５所示ＥｘｏＩＩＩ酶切的时间越长，笑光信号越大６０ｍｉｎ后，且在反应一几乎达到平台，ＥｘｏＩＩＩ，因此辅助的第次循环放大过程中的时间选定为６０ｍｉｎ。巧００—４０００ＩＪＪ３５００３０００／＾＾２５００Ｘ２０００／１５００／１００００２０４０６０８０１００１２０１４０ＥｘｏＩＩＩｃｌｅａｖａｇｅＴｉｍｅ（ｍｉｎ）一３．５次放大过程中Ｅｘｏｍ消化时间对传感器巧光信号的彩响图第。误差棒是３次平行实验的标准偏差－３３－ 基于滚环扩巧和核酸外网酶ＩＩＩ辅助循环放大的島灵敏巧光化物巧感器研允３．３．４ｍｉｃｒｏ民ＮＡ的检测分析在最佳的实验条件下－－－，考察了ＥｘｏＩＩＩＲＣＡＥｘｏＩＩＩ巧光传感器检测７ａ的线Ｉｅｔ－性检测区间和最低检测浓度，通过将不同浓度的ｅｔ７ａ与发夹ＤＮＡ在ＥｘｏＩＩＩ存ｌ－在下进行解育．ｔ，得到了巧光变化情况。从图３６Ａ可Ｗ看出，随着ｌｅ７ａ的浓度从０增加到－ｌＯｐＭ，巧光强度逐渐增大，表明发夹ＤＮＡ与ｌｅｔ７ａ杂交形成了双链ＤＮＡ一的结构，，继而发生了ＥｘｏＩＩＩ辅助的第次循环放大第二次ＲＣＡ放大和ＥｘｏＩＩＩ辅助的第Ｈ次循环放大－７ａ。图３．６Ｂ描绘了传感器的巧光强度在ｌｅｔ浓度处于１ａＭ至１０ｐＭ范围时，有好的线性关系，线性相关系数为０．９９９，检测限为化３２ａＭ。Ａ５０００？４０００ｚ：ｒ一Ｌｅ－…＼＼ｔ７ａ同二每３０００；１—Ｃ＼＼Ｘ０．００１＿。２０００１二ｔ—誦三￣￣￣￣Ａ０￣■Ｉ■Ｉ巧０５４０５６０５８０６００Ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ（ｎｍ）巨５０００＝４０００至＾３０００Ｃ．ＸＩ２０００．呈Ｘ１０００ｙ０＾￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣—．．．．．．０．．．－４－３－２－０１２３４５６１－ｌ７ａｆＭｌｏｅｔｇ［］（）＾Ｑ－－３．６图（Ａ）不同浓度Ｌｅｔ７ａｅｔ７ａ巧度之间的检测黄光光谱图。（Ｂ）巧光强度与Ｌ关系。误差棒是３次平行实验的标准偏差３．３．５选择性考察为了验证本传感器对ｅ－ＲＮＡｌｔ７ａ检测的选择性，我们选用其它的ｍｉｃｒｏ为干－３４－ 硕±学位论文扰物进行对照实验－７ｅｔ－７ｍ化－２２２ｍ化－，其中包括ｌｅｔ家族中的ｌｉＷ及和２２３。结ｅ－果如图３．７所示，只有在ｌｔ７ａ存在的情况下，该传感器才有很好的信号响应，而－同等实验条件下，其它的ｍｉｃｒｏＲＮＡ几乎检测不到英光信号。因此，该方法对ｌｅｔ７ａ的检测具有良好的选择性。６０００５０００呈自若４０００■３〇〇〇Ｉ圓２〇〇〇圓三山１０００Ｉ－－Ｂ－ｌａｃｋＬｔ－７ａＬｅｔ７ｉＲ２２２ｍｉＲ２２３ｅｉｍ３－图．７Ｌｅｔ７ａ的选择性考察。误差棒是３次平行实验的标准偏差３．４小结本章构建了一种滚环扩增娇连的两次核酸外切酶ＩＩＩ辅助放大的多重放大巧光ＲＮＡ’ＲＮＡ互传感器用于ｍｉｃｒｏ的检测。该方法使用３端凸出又与目标ｍｉｃｒｏ补的发夹ＤＮＡ作为识别靴标元件，当目标ｍｉｃｒｏＲＮＡ存在时，它将与发夹ＤＮＡ杂交，ＤＮＡ’Ｅｘ从而打开发夹形成原发夹的３端平齐的双链结构，在ｏＩＩＩ的辅助下发生靴标循环放大，ＤＮＡ中ＲＣＡ反应的引物链ＲＣＡ反同时释放发夹用来引发，发生应，得到的ＲＣＡ产物与单链Ｔａａｎ，在Ｅｘｏｉｎ的辅助下ｑＭ探针结合，发生ＲＣＡ产物循环，３２ａ，英光信号被放大。Ｈ次的放乂过程使得传感器的检测限达到０．Ｍ十分灵敏，也展现出了较好的选择性，该传感器非常适用低丰度、高同源性的ｍｉｃｒｏＲＮＡ分析。此外，滚环扩增反应和核酸外切酶ＩＩＩ酶切反应都在恒温下进行，无需复杂的温控循环仪器，通过设计发夹ＤＮＡ的序列，可Ｗ用于其它ｍｉｃｒｏＲＮＡ的，，检测，通过设计民ＣＡ中环形ＤＮＡ模板的序列可扩増出更多的功能ＤＮＡ序列赋予传感器更多功能，该传感器在癌症早期诊断，生物医学、生物学和生物传感等领域有较好的应用前景。－３５－ 基于滚环扩增和核酸外切酶ｉｎ辅助循环放大的高灵敏巧光生物传感器研巧第４章基于滚环扩增和核酸外切酶ＩＩＩ辅助循环的双重＋放大黄光传感器用于ＡＴＰ和Ｋ的检测４．１前言生物体内含有许多重耍的小分子和离子，它们是生命活动重要的参与者，其含量的变化直接反映着机体的健康状态，如ＡＴＰ的含量可反映细胞的生长状态１＂２１ｉｗｉ，ＡＴＰ的中钟离子调节着细胞的渗透性和其它离子的浓度。文全称为腺嚷一一＞岭核巧Ｈ稱酸，它是由分子腺嘿岭，分子核糖１＾１及云个憐酸基团组成的高能－？？，ＡＴＰＡＰＰＰ，其中Ａ表示腺巧，Ｔ化合物分子的结构式可简写为表示兰个，Ｐ＂＂？则表示磯酸基团。代表普通的化学键，代表高能礎酸键，高能憐酸键断裂时ＵＷ＂会释放大量的能量ｎＡＴＰ被认为是生命的能量分子，作为细胞内能量传递的分＂，起着储存和传递化学能的作用。ＡＴＰ存在于所有有机体中子货币，参与着机ＵＷ体的新陈代谢，，在生物合成神经活动，主动运输等方面发挥着重要的作用ｔＭＳｊｔｉＷ也充当着神经传递和炎症过程中的信号分子。体内ＡＴＰ水平异常ＵＷ１５２［］、血管疾病与许多疾病息息相关，如屯，等阿尔兹海默症帕金森症。常ｉＷｔ常被用作指示剂，乡断细胞活性或细胞损伤及微生物污染ＡＴＰ可Ｗ。ｉｓｓ通过细胞内糖酵解ｔｉ、Ｈ綾酸循环Ｗ及氧化憐酸化反应等多个途径产生。神离子＋Ｋ、肌和神经肌肉均需要相对恒定的钟离子浓（）是细胞内液中主要的阳离子，屯ｔｉｓｅ’ｗｉ度Ｗ维持正常的应激性，同样也是植物生长过程中所需要的重要营养物质。＋因此精确地检测ＡＴＰ，Ｋ这类物质，在生物化学，临床医学Ｗ及食品卫生等方面方面有着重要的意义。ｉｓｓＴＰｔｉ传统的Ａ检测方法主要包括高效液相色谱法，质谱分析法及生物ＵＭ１发光法。虽然这些方法均可灵敏地检测ＡＴＰ，但通常耗资高，方法复杂，实验操作繁琐，而且难区分ＡＴＰ的类似物。近些年来，基于核酸适配体（Ａｐｔａｍｅｒ）发展起来的传感方法在ＡＴＰ分析检测中显示出了的巨大潜能也发展了多Ｕｓｗｗ［ｉＷ［ｉＷ种结合了纳米材料、石墨稀和酶的适配体传感器用于ＡＴＰ的检测。但因ＡＴＰ与其适配体结合的解离常数较高，若不经信号放大，灵敏度不太令人满＋意，Ｋ。检测金属离子常用的方法为原子吸收光谱法同样适用该方法进斤检测。最近，发展Ｔ很多基于有机物识别钟离子的癸光传感器，如冠趟类化合物的神离ＵＷｆｗ］一子英光探针。杨等合成了类非冠酸类的小分子化合物，该化合物能够识＋ＰＥＴ一别Ｋ，并通过光诱导转移（）的过程产生巧光信号增强。也有些基于核酸＋－适配体和金纳米颗粒的ｕｅｓｉｗｉＫ巧光传感器相继被报道。善 硕±学位论文本章利用滚环扩增技术（ＲＣＡ）和核酸外切酶ＩＩＩ（ＥｘｏＩＩＩ）辅助循环技术，＋一种检测ＡＴＰ和Ｋ的双重放大英光传感方法发展了。该方法的原理是基于ＡＴＰ＋和Ｋ可Ｗ抑制Ｓ１核酸酶的活性，从而阻止Ｓ１核酸酶水解引发艮ＣＡ反应的引物链，使得ＲＣＡ反应发生，得到可与ＴａｑＭａｎ探针互补杂交的ＲＣＡ产物，在核酸外切酶ＩＩＩ水解ＴａＭａｎ探针后，。与此同时ｑ产生增强的焚光信号，ＲＣＡ产物由’Ｍ于其凸出的３端而免遭酶切，继续与新的Ｔａｑａｎ探针循环杂交，癸光信号大大＋増强，且巧光强度与ＡＴＰ或Ｋ的浓度呈正相关。因此，通过测定癸光值的改变＋量便可实现对ＡＴＰ和Ｋ的定量检测。４．２实验部分４．２．１试剂和仪器本章中使用的所有核昔酸链均由上海生工生物工程股份有限公司合成（序列见表４．１）并且都经过ＨＰＬＣ纯化。ＡＴＰ、王磯酸尿巧（ＵＴＰ）、Ｈ磯酸鸟巧（ＧＴＰ）、Ｈ憐酸胞巧（ＣＴＰ）均购买于上海生工生物工程股份有限公司。Ｓ１核酸酶（１００Ｕ－１ｈ）从ＴｅｒｍｏＦｉ化ｅｒＳｃｉｅｎｔ近Ｃ公司购买，Ｓ１核酸酶的缓冲溶液（２０ｍＭＮＡｃ冲．ｇ，１５０ｍＭＮａＣｌＷ及ｌｍＭＺｎＳ〇４Ｈ４．５）用于Ｓ１核酸酶的稀释Ｗ及酶切反应，核，ｐ酸外切酶ＩＩＩ、ＢｓｔＤＮＡ聚合酶（大片段）、Ｅ．ｃｏｌｉＤＮＡ连接酶、脱氧核糖核巧酸混合液（ｄＮＴＰｓ）Ｗ及ＢＳＡ均从ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓｙｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ，ＵＳＡ）购买。ＫＣｌ’ＮａＣｌ，ＣａＣｂ，ＭｇＣｋ，ＨｇＮ〇３，ＣｕＳ〇４，ＡｇＮ〇３均为分析纯，且都从上海国药集－ｌｌｉ团化学试剂有限公司购买。所有的试剂均用由ＭｉｌｉｐｏｒｅＭｉｌｉＱ超纯水仪（Ｂｉｌｌｅｒｃａ，ＭＡ，ＵＳＡ）净化的超纯水配制１８．２，电阻率大于ＭＱ。■－７０００巧光分光光度计ｍａｎ探针的英光检测仪器为Ｆ（ＨｉｔａｃｈｉＪａｎ），Ｔａ，叩ｑ５－激发波长为４９２ｎｍ，巧光发射光谱扫描范围为１０６００ｍｎ１ｃｍ的标准石英比色，皿．０ｎｍ９５０Ｖ。，激发光和发射光的狭缝宽度均为５，检测电压为表４．１本实验中所使用的ＤＮＡ序列信息’’一名称序列（５３）＾ＤＮＡＧＴＡＧＧＴＴＧＴＡＧＧＡＧＧＡＧＡＡＴＴＧＧＧ－ＣＣＴＡＣＡＡＣＣＴＡＣ佳锁探针Ｐ０３ＡＡＡＣＣＴＣＧＡＣＴＧＣＡＡＧＣＴＣＣＧＡＣＣＴＡＣＣＣＡＣＣＡＣＣＣＡＡＴＴＣＴＣＣＴＭａｎ探针－Ｔａ（ＦＰ）ＣＧＡＣＣＴ（ＴＡＭＲＡ）ＡＣＣＣＦＡＭｑ－３７－ 基于滾环扩増和核酸外切酶山辅助循环放大的高灵敏巧光生物传感器研巧４．２．２环形探针的制备５Ｘ５０ｍｒ－将６的杂交缓冲液（１ＭＴｉｓＨＣｌＨ８．０５００ｍＭＮａＣｌ２０ｍＭ咕，ｐ，，ＭｇＣｂ），８扣挂锁探针（ｌＯｍＭ）１＾及１０＾１１＾连接探针（ｓＤＮＡ）混合，并将混°５Ｃ０ｍｉｎ３ｈ＾合液加热至９保持１，然后在内逐步缓慢冷却至室温。接着加入６叫Ｉ—ｉｘ－Ｅ．ｃｏｌｉ连接酶（１Ｕ叫／）、４ＵｎＬｌ〇的连接酶反应缓冲溶液（３００ｍＭＴｒｉｓＨＣｌ，－＋ｉｐＨ８．０，４０ｍＭＭｇＣｌ２，１０ｍＭＤＴＴ，２６０ＮＡＤ和５００帖ｍＬＢＳＡ）＾及４阵°°超纯水于１６Ｃ下反应连接。１２ｈ后，将反应液置于６５Ｃ下２０ｍｉｎＷ灭活连接酶Ｉ。然后加入１咕核酸外切酶Ｉ（２０Ｕ叫／）Ｗ及１呼核酸外切酶ＩＩＩ（１００Ｕｉ°°Ｈｌ／）在３７Ｃ下反应过夜将单链和双链ＤＮＡ切除，最后两种酶在９０Ｃ下灭活°２０ｍｉｎ。将得到的环形模板储存在４Ｃ冰箱待用。＋４．２．３ＡＴＰ和Ｋ的检测—＋１将不同浓度的ＡＴＰ或Ｋ溶液与浓度为８ＵｍＬ的Ｓ１核酸酶在室温下解育１０ｍｉｎ，而后加入沁ＮＡ（终浓度为４００ｎＭ）的Ｓ１核酶缓冲溶液与不同浓度的Ｓ１°°核酸酶在３７Ｃ下赔育３０ｍｉｎ，然后于９５Ｃ下反应５ｍｉｎ使酶失去活性Ｗ终止酶切反应。４．２．４滚环扩增反应＇将上述的酶切反应物与５００＾１的（１１们口５，３００ｎＭ环形探针１．２ＵＢｓｔＤＮＡｔ＾及－聚合酶混合于１０咕＾的ＴｈｅｒｍｏＰｏＩ缓冲溶液中（２０ｍＭＴｒｉｓＨＣＩＨ８．８１０ｍＭ，ｐ，°ＫＣ－ｌ１０ｍＭ（ＮＨＳ〇４〇．ｌ％ＴｒｉｔｏｎＸ１００），然后将反应混合物在６５Ｃ，４）２，下反°８０１１１沾＞１应２ｈ后（：热失活２〇＾，从而得到ＲＣＡ产物。，升温至（灭活酶４．２．５核酸外切酶ＩＩＩ辅助的循环放大５Ｍａｎ探针ｘ－将ｘＬ浓度为ｌ＾ｌＭ的Ｔａ、５ｌＬ１０ＮＥＢ（１００ｍＭｂｉｓＴｒｉｓ｜ｑ＾缓冲液ｌ－ＨＣｍＭＴ１１００ＤＴＨ７．０）及０．０２Ｕ的核酸外切酶ＩＩＩ加入ＲＣＡ产物中，丙焼，，ｐ°于３７Ｃ避光反应９０ｍｉｎ，然后进行巧光检测。４．３结果与讨论４．３．１检测原理＋基于ＡＴＰ和Ｋ可抑制Ｓ１核酸酶活性的原理，设计出检测运两种物质的双重放大巧光増强传感器，原理如图４．１所示。传感体系中，Ｓ１核酸酶可将民ＣＡ反应的引物链－ｔＤＮＡ酶切成单个或小片段的脱ＲＣＡ反应和氧核糖核昔酸，致使后续的核酸外切酶ＩＩＩ水解ＴａｑＭａｎ探针反应无法进行，此时体系检测不到英光信号。当＋体系中存在ＡＴＰ或Ｋｔ－时，Ｓ１酶的活性位点被封闭，使ＤＮＡ保持完整结构，并－３８－ 硕±学位论文ＤＮＡ模民ＣＡ一条长的与环形板互补杂交进而引发反应得到、含重复序列的单链一ＤＮＡ．１Ａ）ＲＣＡＭａｎ探，进行第次信号放大（图４。然后，得到的产物与Ｔａｑ’Ｍ端凹陷的Ｔａａｎ探针，针杂交，ＥｘｏＩＩＩ水解３ｑ释放癸光报导基团，产生巧光信’号。与此同时，３端凸出的ＲＣＡ产物则免遭酶切，可继续与其它ＴａｑＭａｎ探针杂交，循环往复，进行第二次信号放大，得到大大增强的巧光信号（图４．１Ｂ）。利＋一用两次信号放大，我们设计了种灵敏的ＡＴＰ和Ｋ通用英光传感器。Ａ…ＮＡ八八＾／ｃｉｒｃｕｌａｒｔｅｍｐｌａｔｅ「心攻—Ｃ》＞．Ｓ；：；二ＤＮＡｏｌｍｗａｓｅ１ＯＣ：；ｐｙＡｒｐ＊－’ｄｓ／ＮＴＰ若ＬＮｏＲＣＡＰｒｏｄｕｃｔＢＲＣＡＰｒｏｄｕｃｔｋ？ｉ对单矣‘：＿＿違違系＋图４．１检测ＡＴＰ和Ｋ的双重放大蒙光传感器的设计原理４．３．２传感器的验证＋为了考察该传感器对目标物质的响应情况，将ＡＴＰ和Ｋ分别与Ｓ１核酸酶赔育后，进行巧光检测。激发波长为４９２ｎｍ时，并未检测到ＴａｑＭａｎ探针的巧光，说明体系的背景芙光非常小（图４．２Ａ曲线ａ）。没有目标物质时，体系中的Ｓ１，核酸酶将引发ＲＣＡ反应的引物链－ＤＮＡ水解生ｔ成单个或小片段的脱氧核糖核昔酸，因此无法引发ＲＣＡ反应Ｗ得到与ＴａｑＭａｎ探针杂交的产物，ＴａｑＭａｎ探针上的巧光基闭也不能被ＥｘｏＩＩＩ释放，同样检测不到巧光信号（图４．２Ａ曲线ｂ）。，＋当存在ＡＴＰ或Ｋ时，在５２０ｎｍ处检测到焚光发射（巧光基团ＦＡＭ的特征峰）（图＋４Ａｃ）ｉ，，．２曲线ｄ这是表明Ｓ１核酸酶的活性被ＡＴＰ或Ｋ抑击ｊ从而保ｉ＾＾ＤＮＡ，，不被酶切，民ＣＡ反应得Ｗ顺利进行，产生的ＲＣＡ产物与ＴａｑＭａｎ探针互补杂交后，ＥｘｏＩＩＩ开始水解ＴａｑＭａｎ探针，使巧光基团远离浑灭基团，民ＣＡ产物循环放大，得到増强的巧光信号。－３９－ 基于滚环扩增和校酸外切酶ｍ辅助滴环放大的高灵敏关化生物巧感器研究５０００１１——ＩｒｎｄＳ８：ｂａｃｋｇｏｕ—－＋Ｓ１＾４０００？ｂｔＤＮＡ＊－＾ｄ：ｔＤＮＡ巧１＋Ｋ３０００？＼Ｉ２０００．■Ｉ０■■■Ｉ５２０５４０５６０５８０６００Ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ（ｎｍ）图４．２Ｔａｍａｎ探针的巧光发射光谱图；体系中所使用的＾ＤＮＡ终巧度为４００ｎＭ，Ｓｌ核酸酶的ｑＵ—终浓度为８ｍＬ＼含有０．０２Ｕ的ＥｘｏＩＩＩ，ＡＴＰ和Ｋ＋的终巧度分别为２ｍＭ和１０ｍＭ４．３．３实验条件的优化＋，ＡＴＰＫＳ１在该传感器构建中或对核酸酶的抑制作用是实验的关键，因此＋ＡＴＰ或Ｋ与Ｓ１核酸酶的腮育时间对它们的检测有较大的影响，赔育时间太短，Ｓ１核酸酶仍然存有活性，导致传感器的灵敏度下降，甚至出现假阴性信号。所Ｗ，＋我们对Ｓ１核酸酶与ＡＴＰ、Ｋ的解育时间进行了优化。如图４．３和图４．４所示，巧光强度随着时间的増加迅速增强，当时间达到８ｍｉｎ时，巧光强度基本上达到稳定平台，不再变化，为了确保Ｓ１核酸酶的活性完全被封闭，选择１０ｍｉｎ作为目标物与Ｓ１核酸酶的脾育时间。４０００３０００／Ｉ？２０００／＂１０００／／０３６９１２１５Ｉｎｃｕｂａ化ｔｉｍｅｗｉ化ＡＴＰｍｉｎ（）图４．３ＳＩ核酸酶与ＡＴＰ脾育时间的优化。误差棒是３次平行实验的标准偏差－４０－ 硕±学位论文４０００１１＊＊３０００〇－４＂２０００／Ｘ＂１０００／／０３６９１２１５＂＂＊ＩｎｃｕｂａｔｅｔｉｍｅｗｉｔｈＫｍｉｎ（）＋图４．４ＳＩ核酸酶与Ｋ脾育时间的优化。误差棒是３次平行实验的标准偏差＋４．３．４ＡＴＰ和Ｋ的检测分析Ａ２５００＿２０２０００＾—？ｆ１５００Ｓ，ｌｉ誦呈ＥＩ－、－「Ｉ．０１１１５２０５４０５６０如０６００ＷａｖｅｌｅｎｔｈｎｍＢｇ（）３０００￣１Ｙｚｌ；〇。？２５００二ｉ＾＾＾ｉｏｏｏＫＥｆｈ１５００：：：＝：二造１：＼Ｘ巧—〇？２５２０５４０５６０５８０６００Ｗａｖｅｌｅｎｔｈｎｍｇ（）４图．５不同浓度ＡＴＰ（Ａ）和心（Ｂ）检测的巧光光谱困。体系中所使用的＾ＤＮＡ终浓度为－４００ｉｎＭ，Ｓ１８ＵｍＬ核酸酶的终浓度为，含有０．０２Ｕ的ＥｘｏＩＩＩ－４－１ 基于滚环扩増和核酸外切酶ＩＩＩ辅助循环放大的高灵敏巧光生物传感器研究为了考察该传感器对上述两种物质的响应情况，在已优化好的实验条件下，＋我们分别考察了该民ＣＡ和ＥｘｏＩＩＩ辅助循环的双重放大英光传感器对ＡＴＰ和Ｋ＋的线性检测区间和最低检测浓度，图４．５所示为不同浓度的ＡＴＰ或Ｋ与Ｓ１核酸酶赔育后得到的体系茨光变化情况，Ｂ可看出，随着目标物浓度的通过图Ａ增大，，英光信号强度逐渐增加，对Ｓ１核酸酶的抑制作用越强，，说明目掠物浓度越大更－ＤＮＡ被免遭酶切多的ｔ，得到的民ＣＡ产物也越多，美光信号也越强。图４．６的＋Ｂ分别为ＡＴＰ和Ｋ的工作曲线图５－２００Ｍ－Ａ，它们的线性响应范围分别为ｎ０．５５，；，ｍＭ检测下限分别为０．５ｎＭ和２ｎＭ，线性相关度分别为０．９８７和０．９９０。Ａ２５００■含２０００＾巧。。Ｓｍ５００－■／１ｗ巧圣ｏｏｙ－１２００ｌ０００ｆ｜ＩＣ笔１０００５００－．ｉ二３００．ｒＵＬＩｔＬ．．００Ｏ．ＯＳ０，Ｑ０．１００１５０．２０々了？ｍＭ［頂《）０．００．５１．０１．５２．０么５３．０Ａ了ＰｍＭ［］（）Ｂ＿巧ＯＱ＾Ｉｉ＾这２０００■２６００－３１罵１５００．ｆ曼養三２０００吞Ｓ／＂ｗ§１０００－ｓ】［ＳＣ１６００￣１４００Ｘｆｊ：＾■００——ｉ．■—■—■—■—Ｉｒｒ５００Ｉｔ＾２ｒｒｌｍＭ［ｔＣ］（）０Ｉ０２４６８１０１２＋ＫｍＭ［］（）图＋４．６黄光强度与目标物浓度之间的关系。（Ａ）对ＡＴＰ响应的工作曲线图；（Ｂ）对Ｋ响应的工作曲线图。误差棒是３次平行实验的标准偏差４．３．５选择性考察＋一些其它碱基为了考察本传感器对ＡＴＰ和Ｋ检测的特异选择性，我们选取了＋Ｈ磯酸和离子分别作为ＡＴＰ和Ｋ的干扰物进行对照实验。结果如图４．７和图４．８－４２－ 硕±学位论文所示，显示很好的信号响应，而同等的实验条件只有在目标物存在的情况下，才＋下，其它的物质巧光信号强度的几乎与背景信号无异。因此，该方法对ＡＴＰ和Ｋ的检测有较好的选择性，其类似物不会带来明显的干扰。巧００；３０００．自ｉ２５００？■＾２０００■Ｉ１５００■￣１０００Ｈ■ＢｌａｎｋＡＴＰＣＴＰＧＴＰＵＴＰ图４．７ＡＴＰ检测的选择性考察。误差棒是３次平行实验的标准偏差？３０００３２５〇０曲２０００Ｉ＾Ｃ１５００Ｉ１１０００Ｉ＾５００■＊＋＋２＋２＋２＋２＋＋Ｂａｃ２ＡｌｋＫＣａＮａ邮ＨｇＰｂＣｕｇ＋图４．８Ｋ检测的选择性考察。误差棒是３次平行实验的标准偏差４．４小结本章构建了一个基于滚环扩增和巧酸外切酶ｍ辅助循环的双重放大巧光传感＋＋平台，，利用ＡＴＰ和Ｋ等物质对Ｓ１核酸酶活性的抑制作用实现对ＡＴＰ和Ｋ的检＋测。通过ＡＴＰ或Ｋ对Ｓ１核酸酶活性的抑制，从而保护ＲＣＡ反应的引物链不被水解，使民ＣＡ反应得进行，并顺利地发生后续的核酸外切酶ＩＩＩ辅助巧光信号放大反应。两次恒温放大过程使这种检测方法较为灵敏且无需温控循环，操作简便。＋对ＡＴＰ和Ｋ均有较好的检测线性范围和检测下限，同时也具备较好的特异选择性，＋可用于ＡＴＰ和Ｋ的定量分析。－４３－ 基于滚环扩增和核酸外切酶ＩＩＩ辅助循环放大的高灵敏巧光生物传感器研巧结论本论文将滚环扩增（ＲＣＡ）、核酸外切酶ＩＩＩ（ＥｘｏＩＩＩ）与巧光生物传感方法一相结合，，大量查阅相关文献后构建了类灵敏度高、特异性好的多重放大茨光生物传感平台，实现了对Ｓ１核酸酶ＲＮＡ、、ｍｉｃｒｏ小分子和离子的分析检测。一首先，设计了种艮ＣＡ和ＥｘｏＩＩＩ辅助循环的双重放大传感器用于Ｓ１核酸酶的高灵敏检测。该方法直接将Ｓ１核酸酶作用的底物ＤＮＡ（ｓＤＮＡ）设计为ＲＣＡ１，反应的引物链，当体系中不存在Ｓ核酸酶时沁ＮＡ可与ＲＣＡ反应中的环形模－？板杂交，并在定的反应条件下后动扩增从而产生由无数重复序列串联的民ＣＡ产ＭＭ’物，得到的ＲＣＡ产物可与大量Ｔａｑａｎ探针杂交，使得Ｔａｑａｎ探针的３端变成凹陷状态，进而可Ｗ被ＥｘｏＩＩＩ酶切水解，使巧光报导基团离开浑灭基团从而恢复茨光信号’；与此同时，民ＣＡ产物则因其３端为凸出状态而免遭酶切，将继续与其它ＴａｑＭａｎ探针杂交，循环往复，英光信号大大增强。当存在Ｓ１核酸酶时，ｓＤＮＡ，ＲＣＡＥｘｏＨＩ被其水解成单个或短片段的核昔酸导致反应的引物链缺失，后续的酶切放大反应也无法继续进行，从而无法检测到巧光信号。因此，通过测定英光强度降低情况便可实现Ｓ１核酸酶的检测。两次信号放大过程均在恒温下进行，且通过直接利用Ｓ１核酸酶的反应底物作为民ＣＡ反应的引物链，无需复杂ＤＮＡ链的设计，，。。此外该方法还应用到了实际样品分析中并且表现优良一其次，构建了种民ＣＡ桥连两次ＥｘｏＩＩＩ辅助放大的多重放大巧光传感器用’于ｍｉｃｒｏＲＮＡ的检测。该方法使用３端凸出且与目标ｍｉｃｒｏＲＮＡ互补的发夹ＤＮＡ，ｍｉｃｒｏＲＮＡ，它将与发夹ＤＮＡ杂交作为识别靴标元件当目标存在时，从而打开’发夹形成原发夹ＤＮＡ的端平齐，、目标ｍｉｃｒｏ民ＮＡ的３端凸出的双链结构在ＥｘｏＩＩＩ的辅助下发生祀标循环放大，同时释放发夹ＤＮＡ中用来引发ＲＣＡ反应的引物链，发生民ＣＡ反应，得到的艮ＣＡ产物与单链ＴａｑＭａｎ探针结合，在ＥｘｏＩＩＩ的辅助下，发生民ＣＡ产物循环，巧光信号被放大。Ｈ次的放大过程使得传感器的检测限可Ｗ达到ａＭ级，十分灵敏，且也展现出了较好的选择性。最后，基于ＲＣＡ和ＥｘｏＩＩＩ辅助循环的双重放大巧光传感平台，利用ＡＴＰ和＋＋Ｋ等物质对Ｓ，１核酸酶活性的抑制作用实现对ＡＴＰ和Ｋ的检测。通过ＡＴＰ或＋Ｋ对Ｓ１核酸酶活性的抑制，从而保护民ＣＡ反应的引物链不被水解，使ＲＣＡ反应得Ｗ进行，并顺利地发生后续的核酸外切酶ＩＩＩ辅助巧光信号放大反应。两次恒温＋放大过程使这种检测方法较为灵敏且无需溫控循环，操作简便。对ＡＴＰ和Ｋ均有较好的检测线性范围和检测下限，同时也具备较好的特异选择性，可用于ＡＴＰ和＋Ｋ的定量分析。－４４－ 硕±学位论文参考文献ＩＣｌａｒｋＬＣ，ＬｏｎｓＣＥｌｅｃｔｒｏｄｅｓｓｔｅｍｓｆｏｒｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓｍｏｎｉｔｏｒｉｎｉｎ［］ｙ，ｙｇｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒｓｕｒｅ．ＡｎｎａｌｓｏｆｔｈｅＮｅｗＹｏｒｋＡｃａｄｅｍｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓ１９６２ｇｙｙ，，－１０２１：２９４５（）口．生物传感器及其应用．北京：１９９３］许春向科学出版社，［３］王飞．生物传感器的发展与未来．湖北省环境保护研究所，１９９３４赵常志，孙伟．化学与生物传感器．北京：科学出版社，２０１２［］［５］司：ｔ辉．生物传感器．北京：化学工业出版社，２００２，６ＫｒｅｕｚｅｒＭ０Ｓ山ｌｉｖａｎＣＰｒａｖｄａＭｅｔａｌ．Ｄｅｖｅｌｏｍｅｎｔｏｆａｎｉｍｍｕｎｏｓｅｎｓｏｒｆｏｒ［］，，，ｐ比ｅｄｅ化打ｎｉｎａｔｉｏｎｏｆａｌｌｅｒａｎｔ化ｏｄＥｉｎｂｌｏｏｄｓａｍｌｅｓ．ＡｎａｌｔｉｃａＣｈｉｍｉｃａｇｙｙＵｇ）ｐｙ２００－Ａｃｔａ１４４２１：４５５３，，（）［７］ＷａｎｇＪ．Ｇｌｕｃｏｓｅｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ：４０ｙｅａｒｓｏｆａｄｖａｎｃｅｓａｎｄｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ．Ｅ－ｌｅｃｔｒｏａｎａｌｙｓｉｓ２００１１３１２：９８３９８８，，（）［８］汤扬华，叶雄英．微型机电系统在医疗中的应用．中国机械工程，２００１，１２（２）：２２６－２３１［９］冯东，李雪梅，王丙莲，等．用辣根过氧化物酶生物传感器测定啤酒中的过－氧化氨．酿酒科技２０１２１：３７３９，，（＾［１０ＹａｍａｚａｋｉＴ，ＭｅｎＺ，ＭｏｓｂａｃｈＫ，ｅｔａｌ．Ａｎｏｖｅｌａｍｐｅｒｏｍｅｔｒｉｃｓｅｎｓｏｒｆｏｒ］ｇｏｒｇａｎｏｈｏｓｐｈｏｔｒｉｅｓｔｅｒｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄｅｓｄｅｋｃｔｉｏｎｅｍｌｏｙｉｎｃａｔａｌｔｉｃｏｌｍｅｒｐｐｇｙｐｙｍｉｍｉｃｋｉｎｈｏｓｈｏｔｒｉｅｓｔｅｒａｓｅｃａｔａｌｔｉｃｃｅｎｔ：ｅｒ．Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒ２００１６９１２：ｇｐｐｙｙ，，（）９６９－９７２ＩＩ彭图治．．［，沈莲清酶生物传感器测定于类鲜度的研究应用科学学报，１９９６］，－１４３：３５８３６３（）［１２］董文宾，胡献丽，郑丹，等．生物传感器在水质分析监测中的应用．工业水处理２００５２５３－：１７１９，，（）［１３吴蓬兴．浅议化学传感器在化工气体检测中的应用．科技信息，２００９，（３４）；］３０８－３０８－－［１４］ＷｅｉＹ，ＬｉＢ，Ｗａｎｇ义ｅｔａｌ．ＡｎａｎｏｇｒａｐｈｉｔｅＤＮＡｈｙｂｒｉｄｓｅｎｓｏｒｆｏｒｍａｇｎｉｆｉｅｄｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｍｅｒｃｕｒｙ（ＩＩ）ｉｏｎｓｉｎａｑｕｅｏｕｓｓｏｌｕｔｉｏｎ．Ａｎａｌｙｓｔ，２０１４，－１３９７）：１６１８１６２１（１５李培进．．２００２４５［］，张传本生物传感器及其在军事医学中的应用人民军医，，－５：２４９２５１（）－４５－ 基于滚环扩增和核酸外切酶ＩＩＩ辅助循环放大的高灵敏巧光生物传感器研究［１６］詹正嵩．美军化学战剂侦检装备研宛现状与发展趋势．人民军医，１９９７，６４０－：３１４３１６（）王民化光学生物传感器的研究进展：王祭樊先平．材料导化２００４１８７，，（）－１４１８张正奇．分析化学．北京；２００７［］科学出版社，１９ＺｈｕＸＺｈｏｕＸＸｉ打Ｄ．ＵｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅａｎｄｓｅｌｅｃｔｉｖｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｍｅｒｃｕｒＩＩｉｎ［］，，ｇｙ（）ａｑｕｅｏｕｓｓｏｌｕｔｉｏ打ｂｙｐｏｌｙｍｅｒａｓｅａｓｓｉｓｔｅｄｆｌｕｏｒｅｓｃｅ打ｃｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏ打．良ｉｏｓｅ打ｓｏｒｓａｎｄＢ－ｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ２０１１２６５：２６６６２６６９，，（）ａｎｕＦｅ－２０］ＨｕＤ，ＨｕｇＺＺｔａｌ．Ａｌａｂｅ＾Ｆｒｅｅ，ｕａｄｒｕｌｅｘｂａｓｅｄｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ［，Ｐ，ｑｐ－ｍｏ－ｌｅｃｕｌａｒｂｅａｃｏ打ＬＦＧ４ＭＢ）ｆｏｒｆｌｕｏｒｅｓｃｅ打ｃｅｔｕｒｎｏｎｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＤＮＡａｎｄ（－－ｎｕｃｌｅａｓｅ．ＣｈｅｍｉｓＡＥｕｒｏｅａｎＪｏｕｒｎａｌ２０１１１７５ｔｒｙｐ：１６３５１６４１，，（）－－－－２１ＨｅＨＺＭａＶＰＹＬｅｕｎＫＨｅ化１．ＡｌａｂｄｆｒｅｅＧｕａｄｒｕｌｅｘｂａｓｅｄｓｗｉ化ｈｏｎ［］，，ｇ，ｑｐｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅａｓｓａｙｆｏｒｔｈｅｓｅｌｅｃｔｉｖｅｄｅｔｅｃｔｉｏ打ｏｆＡＴＰ．Ａ打ａｌｙｓｔ，２０１２，１３７（７）：－１５３８１５４０２２ＲｕｔａＪＰｅｒｒｉｅｒＳＲａｖｅｌｅｔＣｅｔａｌ．Ｎｏｎｃｏｍｅｔｉｔｉｖｅ打ｕｏｒｅｓｃｅ打ｃｅｏｌａｉｚａｔｉｏｎ［］，，ｒ，ｐｐａｔａｍｅｒ－ｂａｓｅｄａｓｓａｆｏｒｓｍａｔｌｌｍｏｌｅｃｕｌｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．ＡｎａｌｉｃａｌＣｈｅｍｉｉｓ化２００９ｐｙｙｙ，，８－１（１７）：７４６８７４７３ｓｖａｎｏｏｒｎｍａ－也ｒｏｕｕｔ２３］ＬｏｏｍａｎＥＥＤｌｅｎＡＭＷａｔＪＷｅｔａｌ．Ｈｉｈｈｓｃｒｅｅｎｉｎ［，，，ｇｇｐｇ－ｂａｓｅｄｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｏｗｉｔｈｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄｍｅ化１ｉｏ打ａｆｆｉｎｉｔｙｌａｒｉｚａｔｉｏ打ｄｅｔｅｃｔｉｏ打ａｐ，ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓａｓｓａｙｆｏｒｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅｓ．ＡｓｓａｙａｎｄＤｒｕｇＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔＴｅｃｈｎｏ－ｌｏｉｅｓ２００３１３：４４５４５３ｇ，，（）口４］ＴｉａｎＪＮ，ＺｈｏｕＬＪ，ＺｈａｏＹＣ，ｅｔａｌ．Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄｄｅｔ：ｅｃｔｉｏｎｏｆｔｕｍｏｒｍａｒｋｅｒｓｗｉ化＊ｒｒｍｌｔｉｃｏｌｏｒｕａｎｔｕｍｄｏｔｓｂａｓｅｄｏｎ打ｕｏｉｅｓｃｅｎｃｅｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ．ｑｐＴａｔ－ｌａｎａ２０１２９２１：７２７７，，（）２５ＭｏｅｒｋｅＮＪ．ＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅＰｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎＦＰＡｓｓａｙｓｆｏｒＭｏｎｉｔｏｒｉｎ［］（）ｇＰｅｔ－－ｔｐｉｄｅＰｒｏ１；ｅｉｎｏｒＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＰｒｏｅｉｎＢｉ打ｄｉｎ．ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉ打ＣｈｅｍｉｃａｌｇＢ－ｉｏｌｏ０９：１ｇｙ，２０，１１１５（）２６ＦｒｅｅｍａｎＢＤＢｕｃｈｍａ打Ｔａ－－ａＧＭｃＧｒａｔｈＳｅｔａｌ．Ｔｅｍｉｔｅｄｉｒｅｃｋｄｄｅｔｅｒｍｉｎｔｏｒ［］，，，ｐｙｉ打ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏ打ｗｉｔｈｆｌｕｏｒｅｓｃｅ打ｃｅｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎｄｅｔｅｃｔｉｏｎｆｏｒａｎａｌｙｓｉｓｏｆｓｉｎｇｌｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓｉｍｐｌｉｃａｔｅｄｉｎｓｅｐｓｉｓ．ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒＤ－ｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ２００２４４：２０９２１５，，（）－－ｍｏ２７ＹｕａｎＩ＾ＬｉｎＷＹ＾ｈｅｎＫＢｅｔａｌＦ民ＥＴｂａｓｅｄｓｍａＵｌｅｃｕｌｅｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎ［］．ｔ，，ｇ，ｒｏｂｅｓ：ｒａｔｉｏ打ａｌｄｅｓｉ打ａ打ｄｂｉｏｉｍａｎａｉｃａｔｉｏｎｓＡｃｃｏｕｎｔｓｏｉｃａｌｐｇｇｉｇｐｐｌ．ｆＣｈｅｍｅｓｅａｒｃｈ－民２０１３４６７：１４６２１４７３，，（）－４６－ 硕±学位论文２８ＢａａｒＢＴＷａｎｇＥＳＬｉｎＭＺｅｔａＬＩｍｒｏｖｉｎｂｒｉｈｔｎｅｓｓａ打ｄｈｏ１：ｏｓｔａｂｉｌｉｔｙｏｆ［］ｊ，，，ｐｇｇｐｇｒｅｅｎａｎｄｒｅｄｆｌｕｏｒｅｓｃｅ打ｔｐｒｏｔｅｉ打ｓｆｏｒｌｉｖｅｃｅｌｌｉｍａｇｉ打ｇａｎｄＦＲＥＴｒｅｐｏｒｔｉｎｇ．－ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＲｅｏｒｔｓ２０１６６０８８９：１１２ｐ，，口）Ｓａｎ－［２９ｔｉｓａｖｌｊｅｖｉｃＭＫｒｉ之ｋｏｖａＳＡｄａｍＶｅｔａｌ．ｕａｎｔｕｍｄｏｔｓｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ］，，，Ｑｒｅｓｏ打ｒｒａｎｓｆｅｒ－ｂａｓｅｄ打ａ打ｏｓｅ打ｓｏｒｓａｎｄｈｅａｎｃｅｅｎｅｇｙｔｔｉｒａｐｐｌｉｃａｔｉｏ打．技ｉｏｓｅｎｓｏｒｓａｎｄｏｅｅｃｏｎｃｓ—Ｂｉｌｔｒｉ２０１５７４：５６２５７４，，３０ＨＹＸＪｎｅａｒｔ－ＷａｎＷａｎｉＪＹｔａｌ．Ｇｏｌｄ打ａｎｏｉｃｌｅｂａｓｅｄｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃａｎｄ［］，ｇ，ｇ，ｐ＂＂－ｂｔｕｍｏ打ｆｌｕｏｒｅｓｃｅ打ｔｒｏｅｆｏｒｍｅｒｃｕｒＩＩｉｏ打ｓｉ打ａｕｅｏｕｓｓｏｌｕｔｉｏ打．Ａｎａｌｔｉｃａｌｐｙ（）ｑｙＣｈｅｍｔｒ－ｉｓｙ，２００８，８０（２３）：９０２１９０２８－３１ＧａｒａｒｄＣＢｏｒｈｉＮ．ＦＲＥＴｂａｄｍｏｌｅｃｕｌａｒｔｅｎｓｉｏｎｍｉｃｒｏｓｃｏ．Ｍｅｔｈｏｄ２０１６］，ｓｅｓ［ｙｇｐｙ，，９４－：３３４２３２ＦｅｎＤＳｏｎＹＳｈ－－ｉＷｅｔａｌ．Ｄｉｓｔｉ打ｕｉｓｈｉｎｆｏｌａｔｅｒｅｃｅｔｏｒｏｓｉｔｉｖｅｃｅｌｌｓｆｒｏｍ［］，ｇ，ｇ，ｇｇｐｐ－－ｆｏ－Ａｎｌａｔｅｒｅｃｅｐｔｏｒ打ｅｇａｔｉｖｅｃｅｌｌｓｕｓｉｎｇａ打ｕｏｒｅｓｃｅ打ｃｅｏｆｆｏｎｎａｎｏｐｒｏｂｅ．ａｌｙｔｉｃａｌＣｈｅｍ—ｉｓｔｒｙ２０１３８５１３：６５３０６５３５．，，（）［３３］许潇，李娜，李克安．焚光相关光谱的原理、技术及应用．现代化器，２００８，－５１４５：１（）Ｍ－３４ｉａｉＨＭａｒｕａｍａＩＮ．Ａ打ａｌｓｉｓｏｆｏｆｌｉａｎｄｒｅｃｅＵ＞ｒｉｎｔｅｒａｃｔｉｏ打〇打１：ｈｅ［］ｙｇ，ｙｙｇｐｓｕｒｆａｃｅｏｆｌｉｖｉｎｇｃｅｌｌｓｂｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ．ＴｈｅＯｐｅｎＳｅｃｔｒｏｓｃｏＪｏｕｒｎａ－ｌ２０１０４１：２８３１ｐｐｙ，，（）［３５］Ｍｅｄｉ打ａＭＡ，ＳｃｈｗｉｌｌｅＰ．Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅ打ｃｅｃｏｒｒｅｌａｔｉｏ打ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙｆｏｒｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎ＾－ａｎｄｓｔｕｄｏｆｓｉ打ｌｅｍｏｌｅｃｕｌｅｓｉｎｂｉｏｌｏ．Ｂｉｏｅｓｓａｓ２００２２４８：７５８７６４ｙｇｇｙｙ，，（）［３６］ＨｏｒｎＥＦＹ，Ｖｅｒｋｍａ打ＡＳ．Ａｎａｌｙｓｉｓｏｆｃｏｕｐｌｅｄｂｉｍｏｌｅｃｕｌａｒｒｅａｃｔｉｏ打ｋｉｎｅｔｉｃｓａｎｄｄ－ｉｆｆｕｓｉｏｎｂｙｔｗｏｃｏｌｏｒ打ｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙｅｎｈａｎｃｅｄｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎｏｆｋｉｎｅｔｉｃｓｂｒｅｓｏｎａ打ｃｅｅｎｅｒｔｒａｎｓｆｅｒ．ＢｉｏｈｓｉｃａｌＪｏｕｒｎａｌ２００２ｙｇｙｐｙ，，－８３（１）：５３３５４６［３７］ＨｅｓｔｅｒｋａｍｐＴ，ＢａｒｋｅｒＪ，Ｄａｖｅ打ｐｏｒｔＡ，ｅｔａｌ．Ｆｒａｇｍｅｎｔｂａｓｅｄｄｒｕｇｄｉｓｃｏｖｅｒｙｕｓｉｎｇｆｌｕｏｒｅｓｃｅ打ｃｅｃｏｒｒｅｌａｔｉｏ打ｓｅｃ化ｏｓｃｏｔｅｃｈ打ｉｕｅｓ：ｃｈａｌｌｅｎｅｓａｎｄｓｏｌｕｔｉｏｎｓ．ｐｐｙｑｇｒｒｅｎＴｏ－ＣｕｔｉｃｓｉｎＭｅｄｉｃｉｎａｌＣｈｅｍｉｓｔｒ２００７７１６：１５８２１５９１ｐｙ，，（）－ｍｏ３８ＭｏｅｒｎｅｒＷ．Ｎｅｗｄｉｒｅｃｔｉｏｎｓｉｎｓｉｎｌｅｌｅｃｕｌｅｉｍａｉｎａ打ｄａｎａｌｓｉｓ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎ［］ｇｇｇｙｇｏｆ－ｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓ２００７１０４３１：１２巧６１２６０２ｙ，，（）［３９］ＷａｎｇＢ，ＣｈｅｎＹ，ＷｕＹ，ｅｔａｌ．Ａｐｔａｍｅｒｉｎｄｕｃｅｄａｓｓｅｍｂｌｙｏｆ打ｕｏｒｅｓｃｅｎｔｎｔｒ－ｔｔｏｎｏｉｏｇｅｎｄｏｐｅｄｃａｒｂｏ打ｄｏｔｓｏｎｇｏｌｄｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓｆｏｒｓｅｎｓｉｉｖｅｄｅ化ｃｉｆＡＦＢ－ｌ．ＢｉｏｓｅｎｓｏｒｓａｎｄＢｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ２０１５７８３：６０１６１０，，（）－４７－ 基于滚环扩增和核酸外切酶ｍ辅助循环放大的高灵敏巧光生物传感器研究［４０］Ｙｕａ打Ｌ，ＬｉｎＷ，ＸｉｅＹ，ｅｔａｌ．Ｓｉｎｇｌｅｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｂｅｒ的ｐｏｎｄｓ化Ｈ２０２，ＮＯ，ａｎｄＨ２Ｏ２／ＮＯｗｉｔｈｔｈｒｅｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｓｅｔｓｏｆ幻ｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｓｉｇ打ａｌｓ．Ｊｏｕｒｎａｌｏｆｔｈｅｅｒｃａｎｅｍａｏｃｅ－ｉＣｈ：ＡｍｉｃｌＳｉｔ２０１１１３４２１３０５１３１５ｙ，，（）［４１］唐尧基，樊静，冯素玲环境水样中痕量脱的焚光分析．分析实验室，２００８，－２２１：４８５０（）４２Ｃｈｅ打ＴＴＴｉａｎＸＬｉｕＣＬｅｔａｌ．Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅａｃｔｉｖａｔｉｏ打ｉｍａｉｎｏｆＣｔｏｃｈｒｏｍｅ［］，，，ｇｇｙｃｒｅｌｅａｓｅｄｆｒｏｍｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｕｓｉｎｇａｐｔａｍｅｒｉｃｎａｎｏｓｅｎｓｏｒ．Ｊｏｕｒｎａｌｏｆｔｈｅｅｒ－ｉｃａｎＣｈｅｍｉｃａｌＳｏｃｉｅｔ２０１５１３７２：９８２９８９Ａｍｙ，，（）４３ＳｉｌｖｅｒｓＷＣ，ＰｒａｓａｉＢ，ＢｕｒｋＤＨｅｔａｌ．Ｐｒｏｆｌｕｏｒｏｅｎｉｃｒｅｄｕｃｔａｓｅｓｕｂｓｔｒａｔｅｆｏｒ［］，ｇｒａｉｄｓｅｌｅｃｔｉｖｅａｎｄｓｅｎｓｉｔｉｖｅｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎａｎｄｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｈｕｍａｎｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｓ，ｐ，也ａｔｏｖｅｒｅｘｒｅｓｓＮＱＯｌ．Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ化ｅＡｍｅｒｉｃａｎＣｈｅｍｉｃａｌＳｏｃｉｅｔｙ２０１３１３５１：ｐ，，（）３０９－３１４ＡｄＰａａｓｅｎｓ－４４ｅｇｏｋｅＯＫａｔｅＴｒｋＥＹ．Ａ打ｕｌｔｒｉｔｉｖｅａｌｌｏｅｄｎｅａｒｉｎｆｒａｒｅｄ［］，，ｙ山打ｔｅｒｎａｒｕａｎｔｕｍｄｏｔ－ｍｏｒｏｂｅｆｏｒｑｙｑｌｅｃｕｌａｒｂｅａｃｏｎｎａｎｏｄｉａｎｏｓｔｉｃｂｉｏｇｐｕｅｎｚａｖ－ｉｎｆｌｉｒｕｓＲＮＡ．Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ＆Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ２０１６８０：４８３４９０，，４５ＦｉｒｅＡＸｕＳ．艮ｏｌｉｎｒｅｌｉｃａｔｉｏ打ｏｆｓｈｏｒｔＤＮＡｃｉｒｃｌｅｓ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｓｏｆｌ：ｈｅ［］，Ｑｇｐｇａ－ＮａｔｉｏｎｌＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓ１９９５９２１０：４６４１４６４５，，（）４６ＢｌａｎｃｏＬＢｅｒｎａｄＡＬ＆ｚａｒｏＪＭｅｔａｌ．Ｈｉｈｌｅ班ｃｉｅ打ｔＤＮＡｓｎ化ｅｓｉｓｂ化ｅ［］，，ｙ，ｇｙｙｐｈａｇｅｐｈｉ２９ＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ．ＳｙｍｍｅｔｒｉｃａｌｍｏｄｅｏｆＤＮＡｒｅｐｌｉｃａｔｉｏ打．Ｊｏｕｒｎａｌｍ－ｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｉｓｔｒｙ１９８９２６４１５：８９３５８９４０，，（）［４７］ＡｌｉＭＭ，ＬｉＦ，ＺｈａｎｇＺ，ｅｔａｌ．民ｏｉｌｉｎｇｃｉｒｃｌｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ａｖｅｒｓａｔｉｌｅｔｏｏｌｆｏｒｃｈｅｍｉｃａｌｂｉｏｌｏｇｙ，ｍａｔｅｒｉａｌｓｓｃｉｅｎｃｅａｎｄｍｅｄｉｃｉｎｅ．ＣｈｅｍｉｃａｌＳｏｃｉｅｔｙ民ｅｖｉｅｗｓ，－２０１４４３１０：３３２４３３４１，（）４８ＮｉｌｓｓｏｎＭＭａｌｍｇｒｅ打ＨＳａｍｉｏ化ｋｉＭ，ｅｔａｌ．Ｐａｄｌｏｃｋｒｏｂｅｓ：ｃｉｒｃｕｌａｒｉｚｉｎ［］，，ｐｇｏｌｉｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｆｏｒｌｏｃａｌｉｚｅｄＤＮＡｄｅ化ｃｔｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９４２６５５１８１；ｇ，（）２０８５－２０８８［４９］彭涛，廖东江，莫自耀．核酸等温扩增技术及其应用．北京；科学出版社，２００９ａｈ－－［５０ＤｌＦＯｌｓｏｎＭＶ．Ｃｉｒｃｌｅ化ｃｉｒｃｌｅａｍｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｆｏｒｒｅｃｉｓｅａｎｄｓｅ打ｓｉｔｉｖｅＤＮＡ］，ｐｐａｎａｌｓｉｓ．ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｓｏｆｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｏｆＳｃｉｅｎｃｅ２００４１０１１３：ｙｇｙ，，（）４５４８－４５５３ＯｒａｎｓｓｏｎＪｅ民ｅａ－［５１ＧＫＮｏｎＲ乂ｔｌ？民ａｉｄＩｄｅｎｄｆｉｃａｔｉｏ打ｏｆＢｉｏＭｏｌｅｃｕｌｅｓ］，，ｇｐＡｌｉｅｄｆｏｒＤｅ化ｃｔｉｏ打ｏｆＢｉｏｓｅｃｕｒｉｔｙＡｅ打ｔｓＵｓｉｎ民ｏｌｌｉ打ＣｉｒｃｌｅＡｍｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ．ｐｐｇｇｇｐＰｌｏｓＯｎｅ，２０１２，７（２）：ｅ３１０６８［５２ＳｉｍｉｓｅｍＷＢＬｉｎｄｂｅｒｇＤＲＢｏｏｒｅＪＬ．民ｏｉｌｉｎｃｉｒｃｌｅａｍｌｉｆｉｃａｔｉｏ打ｏｆｍｅｔａｚｏａｎ］，，ｇｐ－４８－ 硕±学位论文ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌｅｎｏｍｅｓ．ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｈｌｏｅｎｅｔｉｃｓａｎｄＥｖｏｌｕｔｉｏｎ２００６３９２；ｇｙｇ，，（）５６２－％７５３ｉＥＢｎ打ａｎＣｅｔａｌＷａｎｇＭａｈｅｒｒｅ．ＤＮＡａｍｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｔｏｌｅｒａｎｔｔｏ［］Ｇ，，，ｐｓａｍ－ｌｅｄｅｒａｄａｔｉｏｎ．ＧｅｎｏｍｅＲｅｓｅａｒｃｈ２００３１４１１：２０９２１６ｐｇ，，（）５４ＣｈｒｉｓｔｉａｎＡＴＰａｔｔｅｅＭＳＡｔｔｉｘＣＭｅｔａｌ．ＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＤＮＡｏｉｎｔｍｕｔａｔｉｏｎｓ［］，，，ｐａｎｄｍＲＮＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏ打ｌｅｖｅｌｓｂｙｒｏｌｌｉｎｇｃｉｒｃｌｅａｍｐｌｉ打ｃａｔｉｏｎｉｎｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｃｅｌｌｓ．Ｐｒｏｎｓ－ｃｅｅｄｉｇｏｆｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓ２００１８２５：１４２３８１４２４３，，〇）ｅｒＭｅｅｔａｅｃｏｎｏｆａｎｅｎｓｕｓａｎ－５５ＡｋｔＦｉＭＧｒｉｍｍＳｌ．Ｄ別ｔｉｔｉｉｎｒｏ化ｉＤＮＡ［］，，，ｇｇｐｍａ＊ｃｈｉｍｅｒａｄｅｖｅｌｏｐｅｄｂｙｅｎｚｙｔｉｃｃｏｖａｌｅｎｔｂｏｎｄｉｎｇｗｉｔｈｐｈｉＸｇｅｎｅＡ．Ａｎａｃａｅｍｓ－ｌｔｉｌＣｈｉｔｒ２０１２８４１１：５０４０５０４６ｙｙ，，（）５６Ｔａ打ＬｉｕＹＡｌｉＭＭｅｔａｌ．Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃａｎｄｕｌｔｒａｓｅ打ｓｉｔｉｖｅｂｉｏａｓｓａｂａｓｅｄｏｎ［］ｇＬ，，，ｙａｄｕａ＾ａｍｐｌｉ打ｃａｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍｕｓｉ打ｇａｐｔａｍｅｒａｎｄＤＮＡｚｙｍｅ．ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｌｘｙ，－２０１２８４１１：４７１１４７１７，（）ｅｔａｈｏｎｃａｎｏ打ｃａｅ－ａｓｍｂｏｆｔｕｎｃｎａ５７ＺｈｕＧＨｕ民ＺｈａｏＺＮｉｌｓｌｆｓｅｌｍｕｌｉｆｔｉｏｌＤＮＡ［］，，，ｙｎａｎｏｆｌｏｗｅｒｓｆｏｒｂｉｏｍｅｄｉｃａｌａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆｔｈｅＡｍｅｒｉｃａｎＣｈｅｍｉｃａｌＳｏｃ－ｉｅｔ２０１３１３５４４：１６４３８１６４４５ｙ，，（）５８ＨｕＲＺｈａｎＺｈａｏＺ，ｅｔａＬＤＮＡＮａｎｏｆｌｏｗｅｒｓｆｏｒＭｕｌｔｉｌｅｘｅｄＣｅｌｌｕｌａｒ［］，ｇ义ｐＩｍａｉｎａｎｄＴｒａｃｅａｂｌｅＴａｒｅ化ｄＤｒｕＤｅｌｉｖｅｒ．ＡｎｅｗａｎｄｔｅＣｈｅｍｉｅ２０１４ｇｇｇｇｙｇ，，５３２３－（：５９３１５９％）９ＷｅｉＸＸｕｅＸＬｉＴｅｔａｌ．Ｕｌｔｒａｓｅ打ｓｉｔｉｖｅａ虹ｄｓｅｌｅｃｔｉｖｅｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃＤＮＡ口］，，，ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｂｎｉｃｋｉｎｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅａｓｓｉｓｋｄｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅａｍｌｉ打ｃａｔｉｏｎ．ｙｇｐ，ｓＡ打ｅｗａｎｄｔｅＣｈｅｍ－ｇｉｅ１９８９４８３７：６８４９６８５２，，（）６０ＨｏｕＴＴＷａｎｕＴ，ｅｔａｌ．ＳｅｎｓｉｔｉｖｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＴ４ｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｋｉｎａｓｅ［］，ｇ义Ｌｐａ－ａｃｔｉｖｈｂａｓｅｄｏｎｃｏｕｌｅｄｅｘｏｎｕｃｌｅｓｅｒｅａｃｔｉｏｎａｎｄｎｉｃｋｉｎｅｎｚｙｒａｅａｓｓｉｓ化ｄｙｐｇｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｓｉｇ打ａｌａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏ打．Ａ打ａｌｙｔｉｃａｌａ打ｄｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１４，－４０６１２：２９４３２９４８（）［６１］ＸｕｅＬ，ＺｈｏｕＸ，ＸｉｎｇＤ．Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅａｎｄｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓｐｒｃｒｔｅｉｎｄ別ｅｃｔｉｏｎｂａｓｅｄｏｎａｒｅｔ－ｅｒｅｄａｍｅｒｈａｒｎｓｗｔｇｔｒｉｇｇａｐｔｉｐｉｉｔｃｈａｎｄｎｉｃｋｉｎｅｎｚｙｍｅａｓｓｉｓｔｅｄｇｆ－ｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｓｉｇｎａｌａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ．ＡｎａｌｔｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒ，２０１２，８４（８）：３５０７３５１３ｙｙ６２ＺｈａｏＪＬｉｕＴＦａｎｅｔａｌ．ＡｎｅｗｓｔｒａｔｅｆｏｒａＤＮＡａｓｓａｂａｓｅｄｏｎａ［］，，Ｑ，ｇｙｙ＊－Ｃｈｅｍｔａｒｇｅｔｔｒｉｇｇｅｒｅｄｉｓｏｔｈｅｒｍａｌｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎｉｅａｃｔｉｏｎ．ｉｃａｌｃａ－Ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｏｎｓ，２０１１４７１８：５２６２５６２４，（）ｅａｒａｓｅｎｓｖｅａｍｅｒ－６３ＴａｎｇＤＰＴａｎＪＬｉＱＦｔｌｉｅｘｅｄ．Ｕｌｔｉｔｉｔａｂａｓｅｄｍｕｌｔｌ［］，ｇ，ｐ，ｐｅｃｏｃｈｅｍｃａｅｅｃｔ打ｓｎｕｓｅｓｎａｗｃａｔａｃｌｅｔｒｉｌｄｔｉｏｂｙｃｏｕｌｉｎｄｉｔｉｉｈａｂｌｉｌｈｓｉｔｈｌｔｉｐｇｇｇｇｙＡｎａ－ｒｅｃｃｌｉｎｇｏｆＤＮａｓｅＩ．ｌｙｔｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ２０１１８３１９：７２５５７２５９ｙ，，（）－４９－ 基于滚环扩增和核酸外切酶ＩＩＩ辅助循环放大的高灵敏焚光生物传感器研究民ＫｏｍｂＡ－６４ｉｃｈａｒｄｓｏｎＣＣｅｒ．ＡＤｅｏｘｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｈｏｓｈａｔａｓｅｅｘｏ打ｕｄｅａｓｅ［］，ｇｙｐｐｆｒｏｍＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ．ｉｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｅｎｚｙｍｅａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｐｅｎｚｙｍｅａｎｄｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９６４，２３９２３９４２－２５０：２（）６５ＨｅｎｉｋｏｆｆＳ．Ｕｎｉｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌｄｉｅｓｔｉｏｎｗｉ化ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅＩＩＩｃｒｅａｔｅｓｔａｒｅｔｅｄ［］ｇｇｂｒｅａｋｏｅ－ｉｎｔｓｆｏｒＤＮＡｓｅｕｅｎｃｉｎ．Ｇｅｎ１９８４２８３５１３５９，ｐｑｇ，口），６６Ｄｏｕａ打ＪＡＭａｃＨａｅＤ，ＧｒａｈａｍＤｅｔａｈＤＭＡｄｅｔｅｃｔｉｏ打ｕｓｉ打ｅ打ｚｍａｔｉｃｓｉ打ａｌ［］ｇ，，ｇｙｇｒｏｄｕｃｔａｎｃａｏｎｓ－ｉｏｎｄＳＥ民Ｓ．ＣｈｅｍｉｃａｌＣｏｍｍｕｎｉｔｉ２０１１４７１６：４６４９４６５１ｐ，，（）６７ＺｈａｏＸＨＪｅｔａ－ＭａＷｕＸＸｌ．Ｇｒａｈｅ打ｅｏｘｉｄｅｂａｓｅｄｂｉｏｓｅｎｓｏｒｆｏｒｓｅｎｓｉｔｉｖｅ［］，Ｑ，，ｐｆｔｂａｓｅｄｏ打－ｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｄｅｅｃｔｉｏｎｏｆＤＮＡｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅｉｎａｉｄｅｄｓｉｇｎａｌａｍｃａｏｎｎａｃａａｃａ－：７０ｐｌｉｆｉｔｉ．ＡｌｙｔｉＣｈｉｍｉｃＡｔ，２０１２，７２７（１０）６７６８Ｘｕａ打ｏｓｖｅｓｏ－ＦＬｕＸＨｉｎＩ，Ｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｌｕｔｉｏ打Ｐｈａｓｅｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌｍｏｌｅｃｕｌａｒ［］，，ｇｂｅａｃｏｎ－ｂａｓｅｄＤＮＡｄｅｅｃｔｔｉｏｎｗｉｔｈｓｉｇｎａｌａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｂｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅＩＩＩｙａｓｓ－ｉｓ：ｅｅｅｃａｌＣｈｅｍｉｓｒｔｄｔａｒｔｒｃｌｉｎ．Ａｎａｌｔｉｃｌ２０１２８４１２：５２１６５２２０ｇｙｇｙｙ，，（）ｅｂｅｒＭｅ－ｏｆｓｕｃｕｒｅ－ｓｅｃ６９ＬｉＲ．ＴｈＦ巨Ｎ１ｆａｍｉｌｔｒｔｉｆｉｃｎｕｃｌｅａｓｅｓｉｎｅｕｋａｒｏｔｉｃ［］ｙｐｙｒｅｗｃｏｍｂ－ＤＮＡｌｉｃａｔｉｏｎｉｎａｔｉｏｎａｎｄｒｅａｉｒ．Ｂｉｏｅｓｓｓ１９９７１９３：２３３２４０ｐ，ｐ巧，，（）７０ＷｅｓｔＳＣ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｖｉｅｗｓｏｆｒｅｃｏｍｂｉ打ａｔｉｏｎｒｏｔｅｉｎｓａｎｄｔｈｅｉｒｃｏｎｔｒｏｌ．Ｎａｔｕｒｅ［］ｐＭｏ－民ｅｖｉｅｗｓｌｅｃｕｌａｒＣｅｌｌＢｉｏｌｏｇｙ２００３４６：４３５４４５．，，（）［７１］ＭａｒｔｉＴＭＦｌｅｃｋＯ．ＤＮＡｗａｉｒｎｕｃｌｅａｓｅｓ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ足ＭｏｌｅｃｕｌａｒＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ，ｐｓ－Ｃｍ：ｌ２００４６１３３３６３５４，，（）７２ＮｏｒｂｅｒＰ技ｅｒｓｔｒｏｍＴＬｉｌｅｖｉｓｔＪＡ．Ｇｅ打ｏｔｙｐｉ打ｇｏｆｃｌｉ打ｉｃａｌｈｅｒｅｓｓｉｍｌｅｘ［］ｇ，ｇ，ｊｑｐｐｖｉｒｕｓｔｙｐｅ１ｉｓｏｌａｔｅｓｂｙｕｓｅｏｆｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｅｎｚｙｍｅｓ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｌｉｎｉｃａｌ２００６－Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏ４４１２：４５１１４５１４ｇｙ，，（）７３Ｇｒ－［］ｉｎｄｌｅｙＮＤＦＷｈｉ１：ｅｓｏ打ＫＬ，民ｉｃｅＰＡ．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｏｆｓｉｔｅｓｅｃｉｆｉｃ，ｐｒｅｃｏｍｂ－ｉｎａｔｉｏｎ．ＡｎｎｕａｌＲｅｖｉｅｗｏｆＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ２００６７５：５６７６０５ｙ，，［７４］ＨａｌｆｏｒｄＳＥ，ＧｏｏｄａｌｌＡＪ．ＭｏｄｅｓｏｆＤＮＡｃｌｅａｖａｇｅｂｙ化ｅＥｃｏＲＶｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｅｎｄｏｎｕｃ－ｌｅａｓｅ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１９８８２７２７：１７７１１７７７，，（）＊７５民ｏｓｅｎ化ａ－ｌＡＬＬａｃｋＳＡ．ＮｕｃｌｅａｓｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｉｎＳＤＳｏｌａｃｉｌａｍｉｄｅｅｌ［］，ｓｐｙｙｇｅ－ｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ．ＡｎａｌｔｉｃａｌＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１９７７８０１）：７６９０ｙ，，（［７６］ＢｉｃｋｅｒＧ，Ｓｃｈ泣ｆｅｒＳ，ＯｔｔｅｒｓｅｎＯＰ，ｅｔａｌ．Ｉｎｈ化ｉｔｉｏｎｏｆｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅｓｂｙｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅｇｒｏｕｐｓｉｎｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ民ｅｓｅａｒｃｈ，－１９８８１６２４：１１６９１１１７０４，（）［７７］ＭｃｌａｕｇｈｌｉｎＬＷ，ＢｅｎｓｅｌｅｒＦ，ＧｒａｅｓｅｒＥ，ｅｔａｌ．Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｇｒｏｕｐｃｈａ打ｇｅｓｉ打化ｅＥｃｏ民Ｉｒｅｃｏｇ打ｉｔｉｏ打ｓｉｔｅｏｎｔｈｅｃｌｅａｖａｇｅｒｅａｃｔｉｏｎｃａｔａｌｙｚｅｄｂｙｔｈｅｅｎｄｏｎｕｃ－ｌｅａｓｅ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１９８７２６（２３）：７２３８７２４５．，，－５０－ 硕±学位论文－７８ＪｅｌｔｓｃｈＡＦｒｉｔｚＡＡｌｖｅｓＪｅｔａｌ．ＡＦａｓｔａｎｄＡｃｃｕｒａｔｅＥｎｚｍｅＬｉｎｋｅｄ［］，，，ｙＩｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔＡｓｓａｙｆｏｒｔｈｅＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｔｈｅＤＮＡＣｌｅａｖａｇｅＡｃｔｉｖｉｔｙｏｆｅｓ－ＲｔｒｉｃｔｉｏｎＥｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ．ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ１９９３２１３２：２３４２４０ｙ，，（）［７９ＨｉｒａｍａｔｓｕＫＭｉｕｒａＨＫａｍｅｉＳｅｔａｌ．Ｄｅｖｅｌｏｍｅｎｔｏｆａｓｅ打ｓｉｔｉｖｅａ打ｄａｃｃｕｒａｔｅ］，，，ｐｅｎｚｅ－ｌｉｎｋｅｄｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔａ巧ａｙ目ＬＩＳＡｓ化ｍｔｈａｔｃａｎｒｅｌａｃｅＨＰＬＣｙｍ（）ｓｙｐＮ－ａｎａｌｙｓｉｓｆｏｒｔｈｅｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆＮｌ１２ｄｉａｃｅｔｌｓｅｒｍｉｎｅｉｎｈｕｍａｎｕｒｉｎｅ．，ｙｐ－ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１９９８１２４１：２３１２３６．，，（）８０ＳａｍｂｒｏｏｋＪＦｒｉｔｓｃｈＥＦＭａｎｉａｔｉｓＴ．ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ［］，，，２ｎｄｅｄ．ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｒｅｓｓ：ＣｏｌｄＳｒｉｎＨａｒｂｏｒＮｅｗＹｏｒｋｙＰｐｇ，，１９８９８１Ｄｉ打ＪＷｅｉ．Ｐｏ化打ｔｉｏｍｅｔｒｉｃｓｅｎｓｉｎｏｆ打ｕｃｌｅａｓｅａｃｔｉｖｉｔｉｅｓａｎｄｏｘｉｄａｔｉｖｅ［］ｇ，Ｑｇ－ｄａｍａｅｏｆｓ－ｔｎｄｃａｓｅｇｉｎｌｅｓｒａｅｄＤＮＡｕｓｉｎｇａｐｏｌｙｔｉｏ打ｎｓｉｔｉｖｅｍｅｍｂｒａｎｅｇｅ－ｌｅｃｔｒｏｄｅ．Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ皮Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ２０１３４７１３：５５９５６５，，（）［８２］ＨｉｌｌｉｅｒＳＣ，ＦｒｏｓｔＣＧ，ＪｅｎｋｉｎｓＡＴＡ，ｅｔａｌ．Ａ打ｅｌｅｃ杜ｏｃｈｅｍｉｃａｌｓｔｕｄｙｏｆｍａｅ２００４－ｅｎｚｔｉｃｏｌｉｏ打ｕｃｌｅｏｔｉｄｅｄｉｓｔｉｏ打．Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒ６３：３０７３１０ｙｇｇｙ，，（＾）＾８３ＭＺｈａｎＤＺｈａｎＧｅ－Ｗａ打ｔａｌ．Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ１：ｕｒｎｏ打ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＤＮＡａｎｄ［］ｇ，ｇ，ｇ，－ｅｄｏ打ａ－ｌａｂｅｌｆｒｅｅｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｎｕｃｌｅａｓｅａｓｓａｂａｓｔｈｅｇｇｒｅｇａｔｉｏ打ｉｎｄｕｃｅｄｙｅｍ－ｉｓｓｉｏｎｏｆｓｉｌｏｌｅ．ＡｎａｌｔｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ２００８８０１６：６４４３６４４８ｙ，，（）－－８４ＹａｎＸＰｕＦＲｅ打－Ｊｅｔａｌ．ＤＮＡｔｅｍｌａｔｅｄｅｎｓｅｍｂｌｅｆｏｒｌａｂｅｌｆｒｅｅａｎｄｒｅａｌｔｉｍｅ］ｇ，，［，ｐ－ｍａｔｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｔｕｒ打ｏ打ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｅ打ｚｙｉｃ／ｏｘｉｄａｔｉｖｅｃｌｅａｖａｅｏｆｇｓｍ－－ｇｌｅｓｔｉｒａ打ｄｅｄＤＮＡ．ＣｈｅｍｉｃａｌＣｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ２０１１４７２８：８１３３８１３５，，（）８５ＳｈｅｎＺｈｏｕＮＧｕｏＭｅｔａｌ．Ｓｉｍｌｅａｎｄｒａｉｄｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃｓｅｎｓｉｎｏｆ［］Ｑ，，，ｐｐｇｍａ－ｅｎｚｙｔｉｃｃｌｅａｖａｇｅａｎｄｏｘｉｄａｔｉｖｅｄａｍａｇｅｏｆｓｉｎｇｌｅｓｔｒａｎｄｅｄＤＮＡｗｉｔｈｕｎｍｏｄｉ巧ｅｄｌｄｎａｎｏａｒｔｉｃｌｅｓａｓｉｎｄｉｃａｔｏｒ．ＣｈｅｍｉｃａｌＣｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ２００９ｇｏｐ，，８８－：９２９９３１（）［８６］Ｃａｏ民，ＬｉＢ．Ａｓｉｍｐｌｅａｎｄｓｅ打ｓｉｔｉｖｅｍｅｔｈｏｄｆｏｒｖｉｓｕａｌｄｅ化ｃｔｉｏｎｏｆｈｅｐａｒｉ打ｕｓｉｎｇｏｓ－ｐｉｔｉｖｅｌｙｃｈａｒｇｅｄｇｏｌｄｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓａｓｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃｐｒｏｂｅｓ．ＣｈｅｍｉｃａｌＣｏｍｍｕｎ－ｉｃａｔｉｏｎｓ２０１１４７１０）：２８６５２８６７，，（Ｄ—８７ＺｈｏｎＬＰｉｎＰＨＺｈａｏＨａｌ．ＣａｒｂｏｎｎａｎｏｔｕｂｅＤＮＡｈｂｒｉｄｕｓｅｄｆｏｒ［］ｇ，ｇ，义叫ｙａｃｔｉｖｉｔｙｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇａｎｄｍｈｉｂｉＵ）ｒｓｃｒｅｅｎｉｎｇｏｆｎｕｃｌｅａｓｅ．ＡｎａｌｙｔｉｃａＣｈｉｍｉｃａＡｃｔａ，－２０１１７０６１：１７１１７５，（）８８ＰｅｎＹｅ－ｗａｅｄｃａ打打ａｎｏｕｂｅｎｄ打ｔｏ，ＬｉＸＲｅ打Ｉｅｔａｌ．Ｓｉｎｌｌｌｒｂｏｔｓｂｉｉｈｕｍａｎ［］ｇ，，ｇｇ－ｅｎｏｆ化ｌｏｍｅｒｉｃｉｍｏｔｉｆＤＮＡ：ｓｉ打ｉｆｉｃａ打ｔａｃｃｅｌｒａｔｉｏＳＩｎｕｃｌｅａｓｅｃｌｅａｖａｅｒａｔｅ．ｇｇＣｈｅｍ－ｉｃａｌＣｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ２００７，４８；５１７６５１７８，－５Ｎ 基于滚环扩增和核酸外切酶ＩＩＩ辅助循环放大的高灵敏萊光生物传感器研究ｒａｃ－［８９ＨｅＹ．Ｉｎｔｅｔｉｏｎｏｆｓｉ打ｌｅｓｔｒａ打ｄｅｄＤＮＡｗｉｔｈｒａｐｈｅｎｅｏｘｉｄｅ：ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ］ｇｇｓｔｕｄｙａ打ｄｉｔｓａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｆｏｒＳＩ打ｕｃｌｅａｓｅｄｅｔｅｃｔｉｏ打．民ｓｃＡｄｖａ打ｃｅｓ，２０１４，４（３５）：－１８２９４１８３００ｅａ－－９０Ｈｕ民ＬｉｕＹ民ＫｏｎＲＭｔｌ．ＤｏｕｂｌｅｓｔｒａｎｄＤＮＡｔ；ｅｍｌａｔｅｄｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆ［］，，ｇ，ｐ＊ｎｕｃｏｐｐｅｒ打ａｎｏａｉｔｉｃｌｅｓａｓ打ｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｂｅｆｏｒｌａｂｅｌｆｒｅｅｃｌｅａｓｅｐｅｅｃ打ｓｅ打ｓｏｒｓｅｅｃｏｎｃｓ－ｅｎｚｔｔｉｏ：ｙｍｅｄ．Ｂｉｏ足Ｂｉｏｌｔｒｉ２０１３４２４３１３５，，（）９ｓｒａｎｓｆｅ－ａ１ＸｉａｏＹＳｈｕＦＷｏｎＫＹｅｔａｌ．ＦｏｒｓｔｅｒＲｅｏ打ａｎｃｅＥ打ｅｒｒＢｓｅｄ［］，，ｇ，ｇｙＴ良ｉｏｓｅｎｓｉ打ｇＰｌａｔｆｏｒｍｗｉｔｈＵｌｔｒａｓｍａｌｌＳｉｌｖｅｒＮａｎｏｃｌｕｓｔｅｒｓａｓＥｎｅｒｇｙＡｃｃｅｐｔｏｒｓ．Ａ打ａ－ｌｔｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒ２０１３８５１８：８４９３８４９７，，；ｙｙ（）＊－９２ｉｎＨｅＸｉｎＴｅｔａｌ．Ｐｏｌｔｈｍｉ打ｅ１：ｅｍｌａｔｅｄｆｌｕｏｉｅｓｃｅｎｔｃｏｅｒ［］ＱｇＺ，，Ｑｇ，ｙ（ｙ）ｐｐｐｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓｆｏｒｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅｌａｂｅ＾ｆｒｅｅｎｕｃｌｅａｓｅａｓｓａｙａｎｄｉｔｓｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓＡ－ｎｉｎ＾ｓｃｒｅｅｇ．ｎａｌ）ｔｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ２０１３８５２４：１２１３８１２１４３，，（）９３义Ｔｉａｎ义Ｊ．ＫｏｎＺ．Ｍ．ＺｈｕＴ．Ｔ．Ｃｈｅｎａｎｄ义ＣｈｕＴａｌａ打ｔａ２０１５１３１１１６．［］，ｇ，，，，，，９４ＨａｒａｄａＦＤ地化ｅｒＪＥ．ＳｅｃｉｆｉｃｃｌｅａｖａｅｏｆｔＲＮＡｂ打ｕｃｌｅａｓｅＳＩ．Ｎｕｃｌｅｉｃ［］，ｇｐｇｙ－Ａｃｉｄｓ艮ｅｓｅａｒ化１９７５２６：８６５８７１，，（）［９５］ＢｕｔｏｕｒＪＬ，ＭａｚａｒｄＡＭ，ＶｉｅｕｓｓｅｎｓＣ，ｅｔａｌ．Ｋｉｎｅｔｉｃｓｔｕｄｉｅｓｏｆｔｈｅｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓｏｆ－－ｌａｔｉ打ｕｍＤＮＡｃｏｍｌｅｘｅｓｂｙｎｕｃｌｅａｓｅＳＩ．Ｃｈｅｍｉｃｏｂｉｏｌｏｉｃａｌｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ１９９０ｐｐｇ，，－７３２３：１９５２０５（）９６ＯｕＬＪＷａｎＨＢＣｈｕ义ＴｅｒｍｏｎｏｆｍａＵ－ｅｃｕ－ｉｎａｌｒ別ｅｃｔｉｓｍｏｌｌｅｌｉｎｋｅｄＤＮＡ［］，ｇ，ｐｆｏｒｓｅｎｓｉｔｉｖｅｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｄｅ；ｅｃｔｉｏ打ｏｆｒｏｔｅｉｎｂｉｎｄｉｎｂａｓｅｄｏ打ｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄ１ｐｇｃａｏｎｓｔ２０－ａｍｎａ：ｐｌｉｆｉｔｉ．Ａｌｙ，１３１３８２３７２１８７２２３，（）－９７ＺｈｏｕＺＺｈｕＪ＾ｈａｎｅ－ｔａｈＧｕａｄｒｕｌｅｘｂａｓｅｄｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔａｓｓａｏｆＳＩ［］，，，ｇＬｑｐｙ＋ｃａａｎｄ－ｎｕｌｅｓｅａｃｔｉｖｉｔＫ．ＡｎａｌｔｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒ２０１３８５４：２４３１２４３５ｙ，ｙｙ，（）９８ＳａｗｅｒｓＣＬＴｅｃａｎｃ巧－．ｈｂｉｏｍａｒｋｅｒｒｏｂｌｅｍ．Ｎａｔｕｒｅ２００８４５２７１８７：５４８５５２［］ｙ，ｐ，（）Ｂｔ－－９９ＦａａｄｋａｚａｎＨｉｔａｒＮＮａａｒＭｅａｌ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｍ化１５０ａｎｄｍ化３４２ｉｎ［］ｙｙ，，ｊ，ｇｐｌａｓｍａａｒｅ打ｏｖｅｌｐｏｔｅ打ｔｉａｌｂｉｏｍａｒｋｅｒｓｆｏｒａｃｕｔｅｍｙｅｌｏｉ过ｌｅｕｋｅｍｉａ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＴｒａｎｓａｅｃ－ｌａｔｉｏｎｌＭｄｉｉｎｅ２０１３１１１：１１０，，（）１００Ａ打ｄｒｅａ乂ＴｙｌｅｒＪ．Ｍｉｃｒｏ民ＮＡｓａｎｄｃａ打ｃｅｒ：ｓｈｏｉ：ｔＲＮＡｓｏａｌｏｎｗＥｉ．Ｃｅｌｌ［］ｇｇｙ，２００９４－１３６：５８６５９１，（）１０１民ｏｓｓｉＪ．ＮｅｗＨｏｅｆｏｒａＭｉｃｒｏＲＮＡＴｈｅｒａｆｏｒＬｉｖｅｒＣａｎｅ化Ｃｅｌｌ，２００９［］ｐｐｙ，－１３７６：９９０９９２（）－［１０２］ＪｏｈｎｓｏｎＳＭＨｅｌｅＧＪａｃｌｎＳ，ｅｔａｌ．ＲＡＳｉｓｒｅｕｌａｔｅｄｂ１；ｈｅｌｅｔ７ｍｉｃｒｏ民ＮＡ，ｇ，ｙｇｙｆａｍ－ｉｌ．Ｃｅｌｌ２００５１２０５：６３６４７，５ｙ，（）－巧－ 硕±学位论文［１０３ＪｉａｎＷａｎＹＨａｏＹｅｔａｌ．ｍｉＲ２Ｄｉｓｅａｓｅ：ａｍａｎｕａｌｌｃｕｒａｔｅｄｄａｔａｂａｓｅｆｏｒ］ｇＱ，ｇ，，ｙｍｉｃｒｏＲＮＡｄ巧ｅｇｕｌａｔｉｏｎｉｎｈｕｍａ打ｄｉｓｅａｓｅ．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ，２００８，３７：Ｄ９８－Ｄ１０４－１０４Ａｕｒｏｒａ巨ＫＩＳｌａｃｋＦＪ．Ｏ打ｃｏｍｉｒｓｍｉｃｒｏＲＮＡｓｗｉｔｈａｒｏｌｅｉｎｃａｎｃｅｒ．Ｎａｔｕｒｅ［］，Ｒｅｖ－ｉｅｗｓＣａｎｃｅｒ２００６６４：２５９２６９，，（）［１０５］ＨｅＬ，ＴｈｏｍｓｏｎＪＭ，ＨｅｍａｉｍＭＴ，ｅｔａｌ．Ａｍｉｃｒｏ民ＮＡｐｏｌｙｃｉｓｔｒｏ打ａｓａｐｏｔｅｎｔｉａｌｈｕｍａｎｏｎｃｏｅｎｅａ２００５－ｔｕｒｅ４３５７０４３：８２８８３３ｇ．Ｎ，，（）１０６ＴｒｉｃｏｌｉＪＪａｃｏｂｓｏｎＪＷ．ＭｉｃｒｏＲＮＡ：ＰｏｔｅｎｔｉａｌｆｏｒＣａｎｅ巧ＤｅｔｅｃｔｉｏｎＤｉａｎｏｓｉｓ［］乂，ｇ，ａｎｄ－５５Ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ２００７６７１０：４５５３４５，，（）１０７ＲａｎＢＭＲｏｂｌｅｓＡＩＨａｒｒｉｓＣＣ．ＲａｎＢＭＲｏｂｌｅｓＡＩＨａｒｒｉｓＣＣＧｅｎｅｔｉｃ［］ｙ，，，ｙ，ｖａｒｉａｔｉｏｎｉ打ｍｉｃｒｏＲＮＡｎｅｔｗｏｒｋｓ：ｔｈｅｉｍｐｌｉｃａｔｉｏ打ｓｆｏｒｃａ打ｃｅｒｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｎａｔｕｒｅ民ｅｖ－ｉｅｗｓＣａｎｃｅｒ２０１０１０６：３８９４０２，，（）１０８ＭｉｔｃｈｅｌｌＰＳＰａｒｋｉｎＲＫＫｒｏｈＥＭｅｔａｌ．ＣｉｒｃｕｌａｔｉｎｍｉｃｒｏＲＮＡｓａｓｓｔａｂｌｅ［］，，，ｇｂ－ｌｏｏｄｂａｓｅｄｍａｒｋｅｒｓｆｏｒｃａｎｃｅｒｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｓｏｆｔｈｅＮａｔｉｏ打ａｌＡｃａｄｅｍｙｇｏｆ－Ｓｃｉｅｎｃｅｓ２００８１０５３０：１０５１３１０５１８，，（）１０９ＧａｏＹＤｅｉ打ｈｏ民Ａ巨ｍｓｔＭｅｔａｌ．．Ｇａ打ｃｅｒｒｅｓｅａｒｃｈ；ａｓｔｒｅｓｅ打ｔａ打ｄｆｕｔｕｒｅ［，］ｐ，，ｐ，ｐＮａ－ｔｕｒｅ民ｅｖｉｅｗｓＣａｎｃｅｒ２０１１１１１０：７４９７５４，，（）１１０ＣａｌｉｎＧＡＣｒｏｃｅＣＭ．ＭｉｃｒｏＲＮＡｓｉｎａｔｕｒｅｓｉｎｈｕｍａｎｃａｎｃｅｒｓ．ＮａｔｕｒｅＲｅｖｉｅｗｓ［，］ｇＣａｎｃｅｒ６－２００６：８８６６１１５７，，（）［１１１ＣｉｓｓｅｌｌＫＡＳｈｒｅｓ１：ｈａＳＤｅｏＳＫ．ＭｉｃｒｏＲＮＡＤｅｔｅｃｔｉｏｎ：Ｃｈａｌｌｅｎｅｓｆｏｒｔ；ｈｅ］，ｇ，ｃａ－ＡｎａｌｙｔｉｌＣｈｅｍｉｓｔＡｎａｌｙｔｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ７９１３：４７５４４７６１，２００７，（）ａｏｓ－ｕ［１１２Ｌｉ打ｔａ打ａＭ民ａｕｈｕｔ艮ＬｅｎｄｅｃｋｅｌＷｅｔａｌ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏ打ｏｆ打ｏｖｅｌｅ打ｅｓ］ｇＱ，ｇ，，ｃｏｄ－ｉｎｇｆｏｒｓｍａｌｌｅｘｐｒｅｓｓｅｄＲＮＡｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ２００１２９４５４３：８５３８５８，，口）１１；３Ｅｖａｕｒ＆ｎＪＨａｖｅｌｄａＺ．ＭｉｃｒｏＲＮＡｄｅｔｅｃｔｉｏｎｂｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｕｓｉｎ［］乂Ｂｇｙ，ｙｇｇ－ｌｏｃｋｅｄｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｒｏｂｅｓｕｒｅｏｃｏｌｓ：９６．ＮａｔＰｒｔｏ２００８３２１９０１ｐ，（，）ｎｗｏｎｗｏ－ｅｍｅｒａｕｒｅｈｒｉｄｉｚａｉｏｎｆｏｒｍｉｃｒｏｒｒａｄｅｅｃｉｏｎ［１１４］ＪｅｏｇＭＬＹｏｎＪ．Ｔｔｐｔｙｂｔａｙｔｔ，ｇｏｆｌａｂｅ＾ｆｒｅｅｍｉｃｒｏＲＮＡｓｗｉｔｈａｔｔｏｍｏｌｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎａｎｄｓｕｐｅｒｉｏｒｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ．ｅｗａｎｄ化ｅｍａｏｎａｎ－ＡｎＣｈｅｍ：ｉＩｉＵｅｔｉｌＥｄｉｔｉｏ２０１１５０５２１２４８７１２４９０ｇ，，（）１１５Ｔｈｏｍｓｏ打ＪＭＰａｒｋｅｒＪ，ＰｅｒｏｕＣＭ，ｅｔａｈＡｃｕｓｔｏｍｍｉｃｒｏａｒｒａｌａｔｆｏｒｍｆｏｒ［］，ｙｐａｎａＡ－ｌｙｓｉｓｏｆｍｉｃｒｏ民Ｎｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．ＮａｔｕｒｅＭｅ化ｏｄｓ，２００４，１（１）：４７５３［１１６］ＴｏｍａｓＢ，ＷｅｎＺ，ＱｕａｉｄＭ，ｅｔａｌ．Ｐｒｏｂｉｎｇｍｉｃｒｏ民ＮＡｓｗｉ化ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ：ｔｉｓｓｕｅｓｅｃ－ｉｆｉｃｉｔａｎｄｆｕｎｃｔｉｏ打ａｌｉｎｆｅｒｅｎｃｅ．ＲｎａａＰｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｈｅ民ｎａＳｏｃｉｅｔ２００４ｐｙｙ，，－１０１１）：１８１３１８１９（Ｃｈｅ打Ａ－Ｃｚｏ打ｒｏｏｍｅｒｅｔａｌＲｅａｌｉｍｅｕａｎｄｆｉｃａｔｉｏ打ｆｍｉｃｒｏＲＮＡｓ［１１７］，ＲｉｄＤ，ＢＡＪ．ｔｏ，ｑｂｓｅｍ－－ｙｔｌｏｏｐＲＴＰＣＲ．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ民ｅｓｅａｒｃｈ２００５３３２０：ｅｌ７９，，（）－５３－ 基于滚环扩增和核酸外切酶ｉｎ辅助循环放大的高灵敏焚光生物传感器研究Ｗａｎ－１１８ＬｉＪＹａｏＢＨｕａｎＨＺｅｔａｌ？民ｅａｌＴｉｍｅｏｌｍｅｒａｓｅｃｈａｉ打ｒｅａｃｔｉｏｎ［］，，，ｇ，ｇｐｙｍｔ－ｉｃｒｏＲＮＡｄｅｌｅｉｏｎｂａｓｅｄ０打ｅ打ｚｙｍａｔｉｃｓｔ：ｅｍｌｏｏｒｏｂｅｓｌｉａｔｉｏｎ．ＡｎａｌｙｔｉｃａｌｐｐｇＣｈｅｍ－ｉｓｔｒ２００９８１１３：５４４６５４５１ｙ，，（）ｍｏｎｄＣＫ－ｅ１１９民ａ民ｏｂｅｒｔｓＢＳＧａｒｒｅｔｔＥｎｅｌｅＰｔａｌ．Ｓｉｍｌｅｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ［］，，ｙ，ｇｐ，ｑｒ－ｔｐｉｍｅｒｅｘ１；ｅｎｓｉｏｎＰＣ民ａｓｓａｙｆｏｒｄｉｒｅｃｔｍｏｎｉｏｒｉｎｏｆｍｉｃｒｏＲＮＡｓａｎｄｇｓｈｏｒｔ－－ｉｎｔｅｒ托ｒｉｎＲＮＡｓ．ＲＮＡ２００５１１１１：１７３７１７４４ｇ，，（）［１２０］Ｚｈａ打ｇＪ，ＬｉＺ，ＷｕＨ，ｅｔａｌ．Ｕｌｔｒａｓｅ打ｓｉｔｉｖｅｑｕａ打ｔｉｆｉｃａｔｉｏ打ｏｆｍａｔｕｒｅｍｉｃｒｏＲＪ＜ｒＡｓｂｒｅａｌ－ｙｔｉｍｅＰＣＲｂａｓｅｄｏｎｌｉａｔｉｏｎｏｆａｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｍｏｄｉｆｉｅｄＤＮＡｒｏｂｅ．ｇｐＣｈｅｍ４６５－ｉｃａｌＣｏｍｍｉｍｉｃａｔｉｏｎｓ２０１１４７３３：９９４６７，，（）１２１ＸｕＦＤｏｎＣＸｉｅＣｅｔａｌ．民ｅｔｒａｃｔｉｏ打：Ｕｌｔｒａｈｉｈｌｓｅ打ｓｉｔｉｖｅｈｏｍｅｎｅｏｕｓ［］，ｏ，ｇ，ｇｙｇｄｅｌｅＡ－－ｔｉｏｎｏｆＤＮＡａｎｄｍｉｃｒｏＲＮｂｙｕｓｉ打ｓｉ打ｇｌｅｓｉｌｖｅｒ打ａｎｏａｒｔｉｃｌｅｃｏｕｎｔｉｎ．ｇｐｇＣｈｅｍ－ｉｓｔｒ２０１０１６：１０１０１０１６ｙ，，口）［１２２］ＴｕＹ，ＷｕＰ，ＺｈａｎｇＨ，ｅｔａｌ．Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｑｕｅｎｃｈｉｎｇｏｆｇｏｌｄｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ－ｉｎｔｅｒａｔｉｎｗｉｔｈａｃｏ打ｆｏｒｍａｔｉｏ打ｓｗｉｋｈｅｄｈａｉｒｉｎｏｌｉｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｒｏｂｅｆｏｒｇｇｐｇｐ２０１２４８８７－ｍｉｃｒｏＲＮＡｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．ＣｈｅｍｉｃａｌＣｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ：１０７１８１０７２０，，（）ＤＪｕＨｔ－－ｔ１２３ｏｎＨＬｅｉＪｅｔａｌ．Ｔａｒｅｃｅｌｌｓｅｃｉｆｉｃｄｅｌｉｖｅｒｉｍａｉ打ａ打ｄｄｅｅｃｔｉｏｎ［］ｇ，，，，，ｇｐｙｇｇｏｆｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｍｉｃｒｏＲＮＡｗｉｔｈａｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌＳ打〇２ｎａｎｏｐｒｏｂｅ．Ａｎｇｅｗａｎｃｉ１：ｅＣｈｅｍ－ｉｅＩｎ化ｍａｔｉｏｎａｌＥｄｉｔｉｏｎ，２０１２５１１９：４６０７６０１２，（）Ｙ－１２４ＷａｎＺｈｅｎＤ，ＴａｎＱｅｔａｌ．Ｎａｎｏｏｒｅｂａｓｅｄｄｅｔｅｃｔｉｏ打ｏｆｃｉｒｃｕｌａｔｉｎ［］ｇ，ｇ，ｐｇｍｉｃｒｏＲＮＡｓｉｎｌｕｎｇｃａｎｃｅｒｐａｔｉｅ打ｔｓ．ＮａｔｕｒｅＮａｎｏｂｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１１，６（１０）：６６８－６７４－１２５ＣｉｓｓｅｌｌＫＡＲａｈｉｍｉＳｈｒｅｓｔｈａＳｅｔａｌ．Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅ打ｃｅＢａｓｅｄＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆ［］，，乂ＭｉｃｒｏＲＮＡｍｎｉ２１ｉｎＢｒｅａｓｔＣａｎｃｅｒＣｅｌｌｓ．ＡｎａｌｔｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒ２００８８０７：，ｙｙ，，（）２３－１９２３２５１２６ＡｌｌａｗｉＨＴＤ組比ｅｒＪＥＯｌｓｏｎＳｅｔａｌ．ｕａｎｔｉａｔｉｏｎｏｆｍｉｃｒｏＲＮＡｓｕｓｉｎａ［］，ｇ，，Ｑｔｇ２００４１０７－ｍｏｄｉｆｉｅｄｉｎｖａｄｅｒａｓｓａ．ＲＮＡ：１１５３１１６１ｙ，，（）－－１２７ＨａｒｔｉＪＳＧｒｕｎｅＩＮａａｆｉＳｈｏｕｓｈｔａｒｉＳＨｅｔａｌ．ＳｅｕｅｎｃｅＳｅｃｉｆｉｃＤｅｅｃｔｉｏｎｏｆ［］ｇ，ｔ，ｊ，ｑｐＭｉｃｒｏＲＮＡｓｂｙＳｉｇｎａ＾Ａｍｐｌｉｆｙｉ打ｇ民化ｏｚｙｍｅｓ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆｔｈｅＡｍｅｒｉｃａ打Ｃｈｅｍ－ｉｃａｌＳｏｃｉｅｔ２００４１２６３：７２２７２３ｙ，，（）［１２８］Ｈａｃｋｅ打ｂｅｒｇＭ，ＳｔｕｒｍＭ，ＬａｎｇｅｎｂｅｒｇｅｒＤ，ｅｔａｌ．ｍｉ民ａｎａｌｙｚｅｒ：ａｍｉｃｒｏＲＮＡｄｅ化ｃｔ－ｉｏｎａｎｄａｎａｌｓｉｓｔｏｏｌｆｏｒｎｅｘｔｅｎｅｒａｔｉｏ打ｓｅｕｅｎｃｉ打ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ．ＮｕｃｌｅｉｃｙｇｑｇＡｃ－ｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ，２００９３７２：６８７６，（）１２９ＢｉＳＺｈａｎＪＨａｏＳｅｔａｌ．Ｅｘｏｎｅ打ｔｉａｌａｍｌｉｆｉｃａｔｉｏ打ｆｏｒｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ［］，ｇ，，ｐｐｒｅｓｏｎａｎｃｅｅｎｅｒｇｙｔｒａｎｓｆｅｒｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｍｉｃｒｏＲＮＡｉｎｒｅａｌｓａｍｐｌｅｓｂａｓｅｄｏｎａ－５４－ 硕±学位论文ｃｒｏｓｓ－ｃａａ－ｔｌｙｓｔｓｔｒａｎｄｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔｎｅｔｗｏｒｋ．ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ２０１０８３１０：，，（）３６９６－３７０２ＧＳｅｎｓ－１３０ＷａｎｇＺｈａｎＣ．ｉｔｉｖｅＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＭｉｃｒｏＲＮＡｓｗｉ化ＨａｉｒｐｉｎＰｒｏｂｅＢａｓｅｄ［］，ｇＣｉｒｃｕｌａｒＥｘｐｏｎｅｎｔｉａｌＡｍｐｌｉ打ｃａｔｉｏｎＡｓｓａｙ．Ａ打ａｌｙｔｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１２，８４（１６）：７０３７－７０４２ｅｎｒ－１３１ＦａｎＹＣｈＸＴｉＡＤｅｔａｌ．ＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｍｉｃｒｏＲＮＡｓｕｓｉｎｔａｒｅｔｕｉｄｅｄ［］，，ｇｇ，ｇｇｇｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆＣＯ打ｄｕｃｔｉｎｇｐｏｌｙｍｅｒｎａ打ｏｗｉｒｅｓｉｎ打ａｎｏｇａｐｓ．Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ化ｅｅｃａｎｅｍ－ＡｍｒｉＣｈｉｃａｌＳｏｃｉｅｔ２００７１２９１７：５４３７５４４３ｙ，，（）［１３２］ＺｈａｎｇＹ，ＬｉＺ，ＣｈｅｎｇＹ．Ａｍｐｌｉｆｉｅｄｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏ打ｏｆｍｉｃｒｏＲＮＡｓｉｎｈｏｍｏｅｎｅｏｕｓｓｏｌｕｔｉｏｎｗｉｔｈｃａｔｉｏｎｉｃｃｏｎｕｇａｔｅｄｏｌｙｍｅｒｓ．ＣｈｅｍｉｃａｌｇｊｐＣｏｍｍｕｎ－ｉｃａｔｉｏｎｓ２００８４８４８：６５７９６５８１，，（）１３３ＺｈａｎＹ，ＬｉＺ，ＣｈｅｎＹｅｔａｌ．Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃｄ別ｅｃｔｉｏｎｏｆｍｉｃｒｏＲＮＡａｎｄＲＮａｓｅＨ［］ｇｇ，ａｃｔｉｖｉｔｉｎｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓｓｏｌｕｔｉｏ打ｗｉｔｈｃａｔｉｏｎｉｃｏｌｙｔｈｉｏｈｅｎｅｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ．ｙｐｐＣｈｅｍｃａ２００９７２－ｉｌＣｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ２２２２：３１３１７４，，（）１３４Ｃｈｅ打ＹＺｈａｎＸＬｉＤｒ．Ｚ；ｅｔａｌ．Ｈｉｈｌｓｅｎｓｉｔｉｖｅｄｅｔ：ｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｍｉｃｒｏ民ＮＡ［］ｇ，ｇ，，ｇｙ－ｕｓｔ－ｉｎｇｔａｒｅｒｉｍｅｄａｎｄｂｒａｎｃｈｅｄｒｏｌｌｉ打ｃｉｒｃｌｅａｍｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ａｎｇｅｗａ打ｄｔｅｇｐ呂ｐＣｈｅｍ—ｉｅＩｎｂｍａｔｉｏｎａｌＥｄｉｔｉｏｎ２００９４８１８：３３１８３３２２，，（）１３５ＬｉｕＨＬｉＬＤｕａｎＬｅｔａｌ．Ｈｉｈｓｅｃｉｆｉｃａ打ｄｕｌｔｒａｓｅ打ｓｉｔｉｖｅｉｓｏｔｈｅｒｍａｌｄｅｔｅｃｔｉｏｎ［］，，，ｇｐｏｆｍ－ｉｃｒｏＲＮＡｂｙｐａｄｌｏｃｋｐｒｏｂｅｂａｓｅｄｅｘｏｎｅｎｔｉａｌｒｏｌｌｉ打ｇｃｉｒｃｌｅａｍｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ．ｐｐＡｎａ１－ｌｔｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒ２０１３８５６：７９４１７９４７ｙｙ，，（）－１３６ＸｕＦＳｈｉＨＨｅＸｅｔａｌ．ＣｏｎｃａｔｅｍｅｒｉｃｄｓＤＮＡｔｅｍｌａｔｅｄｃｏｅｒ打ａ打ｏａｒｔｉｃｌｅｓ［］，，，ｐｐｐｐｓｔｒａｔｅｇｙｗｉｔｈｉｍｒｏｖｅｄｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙａｎｄｓｔａｂｉｌｉｔｙｂａｓｅｄｏｎｒｏｌｌｉｎｇｃｉｒｃｌｅｐ化ｌｉｃａｔｉｏｎａｎｄｉｔｓａｌｉｃａｔｉｏｎｉ打ｍｉｃｒｏＲＮＡｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｐｐｐｙ，２０－１４８６１４：６９７６６９８２，（）１３７Ｊｏ打ｓｔｒｕＳＰＫｏｃｈＪ，ＫｅｍｓＪ．Ａｍｉｃｒｏ氏ＮＡｄｅｔｅｃｔｉｏ打ｓｓｔｅｍｂａｓｅｄｏ打ａｄｌｏｃｋ［］ｐ，ｊｙｐｒｏｂｅｓｒｏ－ａｎｄｌｌｉｎｃｉｒｃｌｅａｍｌｉｆｉｃａｔｉｏ打．反打ａａＰｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｈｅ民打ａＳｏｃｉｅｔｐｇｐｙ，２９－２００６１：１巧１６７，（）－１３Ｚｈｏｕ乂ＨｕａｎＧａｏｅｔａｌ．ＡｄｕｍｂｂｅＵｒｏｂｅｍｅｄｉａｔｅｄｒｏｌｌｉｎｃｉｒｃｌｅ別，Ｊ［ｇＱ，ｐｇａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｓｔｒａ化ｇｙｆｏｒｈｉｇｈｌｙｓｅｎｓｉｔｉｖｅｍｉｃｒｏＲＮＡｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ，２０１０，３８（１５）：ｅｌ５６ｅｎｔ－－１３９ＷＸｕＹＭａｏＸｅａｌ．ＤＮＡｍｅＢａｓｅｄ民ｏｌｌｉｎＣｉｒｃｌｅＡｍＨｆｉｃａｔｉｏｎＤＮＡ［］乂，，巧ｇｐＭａｃｈｉｎｅｆｏｒＵｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅＡｎａｌｙｓｉｓｏｆＭｉｃｒｏＲＮＡｉ打ＤｒｏｓｏｐｈｉｌａＬａｒｖａ－Ａｎａ－ｔｃａｅｍｔｒ心ｉｌＣｈｉｓｙ，２０１２８４１８：７６６４７６６９，（）－５５－ 基于滚环扩增和核酸外切酶阻辅助循环放大的髙灵敏焚光生物传感器研究［１４０］ＣｈａｉｎＳＣＤｏｌｅＰＳ．Ｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅｍｕｌｔｉｌｅｘｅｄｍｉｃｒｏ民ＮＡｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ０打ｐ，ｙｐｑｅｎｃｏｄｅｄｇｅｌｍｉｃｒｏａｒｔｉｃｌｅｓｕｓｉｎｒｏｌｌｉｎｇｃｉｒｃｌｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ．ＡｎａｌｙｔｉｃａｌｐｇＣｈｅｍ－ｉｓｔｒｙ２０１１８３１８：７１７９７１８５，，（）ｔ［１４１］ＸｕｅＱＬｖ乂ＨｕｉＣ，ｅａｌ．ＡＤＮＡｎａ打ｏｍａｃｈｉｎｅｂａｓｅｄｏｎｒｏｌｌｉｎｃｉｒｃｌｅ，ｇ－－ａｍ－ｐｌｉ打ｃａｔｉｏｎｂｒｉｄｇｅｄｔｗｏｓｔａｇｅｅｘｏ打ｕｃｌｅａｓｅｉｎａｓｓｉｓｔｅｄｒｅｃｙｃｌｉ打ｇｓｔｒａｔｅｇｆｏｒｙ－－ｌａｂｄ＆ｅｅｍｕｌｔｉａｍｌｉ巧ｅｄｂｉｏｓｅｎｓｉｎｏｆ打ｕｃｌｅｉｃａｃｉｄ．ＡｎａｌｙｔｉｃａＣｈｉｍｉｃａＡｃｔａｐｇ，２０－１５８５６：１０３１０９，１４２ＳａｚａｎｉＰＬＬａ打ａｉｄｅ民ＳｚｏｓｔａｋＪＷ．Ａｓｍａｌｌａｔａｍｅｒｗｉｔｈｓｔｒｏ打ａｎｄｓｅｃｉｆｉｃ［］，，ｐｇｐｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎｏｆ化ｅｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅｏｆＡＴＰ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆｔｈｅＡｍｅｒｉｃａｎＣｈｅｍｉｃａｌＳｏｃ－ｉｅｔ２００４１２６２７：８３７０８３７１ｙ，，（）［１４３］杨嘗，鲍金欣，刘绍瑣．高选择性癸光传感器的合成及其钟离子识别．中国化学会学术年会．２０１４１４４］ＴａｔｓｕｍｉＴ，ＳｈｉｒａｉｓｈｉＪ，ＫｅｉｒａＮ，ｅｔａｌ．ＩｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒＡＴＰｉｓｒｅｑｕｉｒｅｄｆｏｒ［ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌａｐｏｐｔｏｔｉｃｐａｔｈｗａｙｓｉｎｉｓｏｌａｔｅｄｈｙｐｏｘｉｃｒａｔｃａｒｄｉａｃｍｙｏｃｙｋｓ．Ｃａｒｄ巧－ｉｏｖａｓｃｕｌａｒｒｅｓｅａｒｃｈ２００３２：４２８４４０，，（）１４５ＬｉｕＪＭＹａ打ＸＲＣｏｍｅｔｉｔｉｖｅａｔａｍｅｒｂｉｏａｓｓａｆｏｒｓｅｌｅｃｔｉｖｅｄｅ化ｃｔｉｏ打ｏｆ［］，ｐｐｙａｄｅ打ｏｓｉｎｅｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅｂａｓｅｄｏｎｍｅ＾＾ｐａｉｒｅｄｍｏｌｅｃｕｌａｒＣＯ打ｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌｓｗｉｔｃｈａｎｄ幻ｕｏｒｅｓｃｅ打ｔｏｌｄｎａｎｏｃｌｕｓｔｅｒｓ．ＢｉｏｓｅｎｓｏｒｓａｎｄＢｉｏｅｌｅｃｌｒｃｍｉｃｓ２０１２３６１：ｇ，，（）－１３５１４１ＭｏｒｏｚＬＬｎ－１４６ＧｒｕｅｎｈａｇｅｎＪＡＬｏｖｅｌｌＰｅｔａｌ．ＭｏｎｉｔｏｒｉｒｅａｌｔｉｍｅｒｅｌｅａｓｅｏｆＡＴＰ［］，，，ｇｆｒｏｍｔｈｅｍｏｌｌｕｓｃａｎｃｅｎｔｒａｌｎｅｒｖｏｕｓｓｙｓ化ｍ．Ｊｏｕｒｎａｌｏｆｎｅｕｒｏｓｃｉｅ打ｃｅｍｅｔｈｏｄｓ，９－２００４１３２：１４５１５２，（）ａ－１４７ＳｚｅｗｃｚｋＡＰ化ｕａＳ．Ａｄｅｎｏｓｉ打ｅ５Ｍｒｉｈｏｓｈａｔｅ：ａｎｉ打ｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｍｅｔａｂｏｌｉｃ［］ｙ，ｐｐｅｒ－ｍｅｓｓｅｎ．ＢｉｏｃｈｉｍｉｃａｅｔＢｉｏｈｙｓｉｃａＡｃｔａ良８八８１〇６１１６巧６１：１〇５１９９８１３６５３：ｇｐ（），，（）３３３－３５３１４８ＢｕｍｓｔｏｃｋＧ．Ｐｕｒｉ打ｅｒｉｃｓｉ打ａｌｉｉ打：Ｉｔｓｕ打ｏｕｌａｒｂｅｇｉ打打ｉｎｇｉｔｓａｃｃｅｔｓ打ｃｅａ打ｄ［］ｇｇｇｐｐ，ｐｔｓｅｘｃｔｎｔｅｓｓａｓｅｗｗｓａｉｉｉｇｆｕｕｒｅ．ＢｉｏｙＮｓ＆民ｅｖｉｅｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｅｌｌｕｌｒ足ｅｖｅ－ＤｌｏｐｍｅｎｔａｌＢｉｏｌｏｇｙ２０１２３４３：２１８２２５，，（）１４９ＩｄｚｋｏＭ，ＦｅｒｒａｒｉＤＥｌｔｚｓｃｈｉＨＩＣ．Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｉ打ａｌｉｉ打ｇｄｕｒｉｎｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．［］，ｇｇｇａ－Ｎｔｕｒｅ２０１４５０９７５００：３１０３１７，，（）５０Ｍｏｔ－ＡＴＰ１ＧｒｕｅｎｈａｅｎＪＡＬｏｖｅｌｌＰｒｏｚＬＬ＾ｅｔａｌ．Ｍｏ打ｉｏｒｉｎｒｅａｌｔｉｍｅｒｅｌｅａｓｅｏｆ［］ｇ，，，ｇｆｒｏｍｔｈｅｍｏｌｌｕｓｃａ打ｃｅｎｔｒａｌ打ｅｒｖｏｕｓｓｙｓ化ｍ．Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ打ｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅｍｅｔｈｏｄｓ，２００４－１３９２：１４５１５２，（）＋２＋１５１ＡｎｎｕｎｚｉａｔｏＬ，ＰｉｎａｔａｒｏＧＤｉ民ｅ打ｚｏＧ．ＰｈａｒｍａｃｏｌｏｏｆｂｒａｉｎＮａ／Ｃａ［］ｇ，ｇｙｅｘｃｈａｎｇｅｒ：ｆｒｏｍｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｉｏｌｏｇｙｔｏｔｈｅｒａｅｕｔｉｃｅｒｓｅｃｔｉｖｅｓ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｉｃａｌｐｐｐｇ－５６－ 硕±学位论文－ｒｅｖ：ｉｅｗｓ２００４５６４６３３６５４，，（）［１５２］ＰｒｚｅｄｂｏｉｒｓｋｉＳＶｉｌａＭ．ＭＰＴＰ：ａｒｅｖｉｅｗｏｆｉｔｓｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｏｆ打ｅｕｒｏｔ：ｏｘｉｃｋ．，ｙｃａｅｕｒｏｓｃｅｎｃｅｅｓｅａｒｃｈ－ＣｌｉｎｉｌＮｉＲ２００１１６：４０７４１８，，（）ｅａ－ｍｏ１５３ＭａＧＹａ打又Ｗａ打Ｋｔｌ．Ａ打ｏｖｅｌｋｉ打ａｓｅｂａｓｅｄＡＴＰａｓｓａｕｓｉ打ｌｅｃｕｌａｒ［］，ｙ，ｇ，ｇｇｅａｃｏｎｃａ－ｂ．ＡｎａｌｙｔｉｌＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３７２１；１３１１３３，２００８，（）１５４ＣａｌｌａｎＪＦＭｕｌｒｏｏｎｅＲＣ，ＫａｍｉｌａＳ．ＬｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＡＴＰｉｎａｕｅｏｕｓ［］，ｙｑｓｏ－ｌｕｔｉｏｎｕｓｉｎｏｓｉｔｉｖｅｌｙｃｈａｒｅｄＣｄＳｅＺｎＳｑｕａｎｔｕｍｄｏｔｓ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆｇｐｇＦｎｃ２００８－１１５７１１ｌｕｏｒｅｓｃｅｅ１８６：１６，，（）［１５５］Ｖａ打ｃｒａｅ打ｅｎｂｒｏｅｃｋ民，ＷｅｂｂＭ氏．Ａｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ，ｒｅａｇｅ打ｔｌｅｓｓｂｉｏｓｅ打ｓｏｒｆｏｒＡＴＰ，－ｓｅｈｅｍｃａｂａｓｅｄｏｎｍａｌｏｎｙｌｃｏｅｎｚｙｍｅＡｓｙ打化ｅｔａ．ＡｃｓＣｉｌＢｉｏｌｏｇｙ２０１５１０１１二，，（）２６５０－２６５７１５６ＷｉｌｅＪＳ，Ｋｕｃｈ化ｈｏｔｌａＪＳｈａＵｅｒＣＣｅｔａｌ‘Ｐｏｔａｓｓｉｕｍｕｔａｋｅａｎｄｒｅｌｅａｓｅｂ［］ｙ，，ｐｙａｅｅｔｓｏｏｄ－ｈｕｍａｎｂ：ｌｏｏｄｌｔｌ．Ｂｌ１９７６４８１８５１９７ｐ，，口）１５７ＭｉｒＴＡＡｋｈｔａｒＭＨ，ＧｕｒｕｄａｔｔＮＧｅｔａｌ．Ａ打ａｍｅｒｏｍｅｔｒｉｃｎａ打ｏｂｉｏｓｅ打ｓｏｒｆｏｒ［］，，ｐ＋－ｔｈｅｓｅｌｅｃｔｉｖｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＫｉｎｄｕｃｅｄｄｏａｍｉｎｅｒｅｌｅａｓｅｄ行ｏｍｌｉｖｉｎｇｃｅｌｌｓ．ｐＢ－ｉｏｓｅｎｓｏｒｓ＆Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ２０１５６８０１５：４２１４２８，，口）１５８Ｋｈｌｎｔ化ｖａＳＶＢａｚｅｌＹＲＶｉｓｈｎ化ｉｎＡＢｅｔａｌ．Ｍｅ化ｏｄｓｆｏｒ化ｅｄｅｔ：ｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ［］ｙ，，，ｏｆａｄｅｎｏｓｉｎｅｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅａｎｄｏｔ：ｈｅｒａｄｅｎｉｎｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｎａｌｙｔｉｃａｌＣｈｅｍ－ｉｓｔｒ２００９６４７：６５７６７３，ｙ，（）ｅｎＡｓｃｏｅａｕｃｏｅｅｎｅｒａｅｓ－ｍａ［１５９］ＫｎｅｄｙＨＪＰｏｕｌｉＥ，ＡｉｎｗＥＫｔｌ．ＧｌｓＧｔＳｕｂｌａｓ，，ｐ－ＭｅｍｂｒａｎｅＡＴＰＭｉｃｒｏｄｏｍａｉｎｓｉ打ＳｉｎｇｌｅＩｓｌｅｔＰＣｅｌｌｓ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｉｃａｌｇｔｒ２７４－Ｃｈｅｍｉｓ１９９９２７４；１３２８１１３２９１ｙ，，（）１６０之ｒａ打ｏｖＧｒｉｏｒＶＰａｌａｃｉｏｓＭａ打ｕｅｌＡＡ打ｚｅ打ｂａｃｈｅｒＰａｖｅｌ，ｎａｔｉｏｎａｌｄｅｓｉ打ｏｆ［］ｙｙｇｙ，，ｇ－ａ打ｕｏｒｅ打ｃｅ－化ｓｃｅｔｕｒｎｏｎｓｅｎｓｏｒａｒｒａｙｆｏｒｐｈｏｓｈａ化ｓｉ打ｂｌｏｏｄｓｅｒｕｍ．Ａｎｇｅｗａ打ｄｐＣｈ－ｅｍｉｅＩｎ化ｒｎａｔｉｏｎａｌＥｄｉｔｉｏｎ２００７，４６４１：７８４９７８５２，（）Ａｅｒ－１６１ＷａｎＪＪｉａｎＺｈｏｕＣｅｔａｌ．化ｍｂａｓｅｄＡＴＰａｓｉｓａｕｓｉ打ａｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ［］ｇ，ｇ乂，ｐｙｇ－ｌｉｈｔｓｗｉｔｃｈｉｎｃｏｍｌｅｘ．ＡｎａｌｔｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００５７７（１１：３５４２３５４６ｇｇｐｙ，）１６；２ＹＹＬｉｕＢｒｅｅｎｔｄｅｅｃｉｏｎｏｆｂａｓｅｄｏｎｓｉｎａｌｉｎＷａｎＷａｎ．Ｆｌｕｏ％ｔｔＡＴＰＤＮＡ［］ｇ，ｇ，ｇｇａｔａｍｅｒａｃｈｅｄａｎａｎｏａｒｃｅｓａｎｏｅｃｈｎｏｏ－ａｔｔｓｉｌｉｃｔｉｌ．Ｎｔｌ２００８１９４１：２９９３０４ｐｇｙ，ｐ，（）ＷａｎＬ－［１６３ＪＷａｎｉｕＸｅｔａｌ．ＡＧｏｌｄＮａｎｏａｒｔｉｃｌｅＢａｓｅｄＡ化ｍｅｒＴａｒｅｔ］ｇ，ｇＬ，ｐｐｇＢｅａｄｏｕｃｅｄａａｓ－ｉｎｄｉ打民ｔｆｏｒＡＴＰＡｓｓａ．ＡｄｖａｎＭｔｅｒｉｌ２００７１９２２：３９４３３９４６ｙ，ｇ，（）ｓｈｅｆ－－１６４ＫａｉＫｈｅｙｒａｂａｄｉＬＭｅｈａｒｄｉＭＡ．Ａｔａｍｅｒｃｏｎｕａｔｅｄｓｉｌｖｅｒｎａｎｏａｒｔｉｃｌｅｓ［］，巧ｐｊｇｐｆｏｒｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌｄｅ化ｃｔｉｏｎｏｆａｄｅｎｏｓｉｎｅｔｒｉｈｏｓｈａｔｅ．Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓａｎｄｐｐ－目ｉｏｅｌｅｃｔｒｏ打ｉｃｓ２０１２３７１：９４９８，，（）－５７－ 基于滾环扩増巧核酸外切酶ｍ辅助循环放大的髙灵敏巧光生物传感器研究［１６５］ＷａｎｇＹ，ＬｉＺ，ＨｕＤ，ｅｔａｌ．Ａｐｔａｍｅｒ／ｇｒａｐｈｅｎｅｏｘｉｄｅｎａｎｏｃｏｍｐｌｅｘｆｏｒｉｎｓｉｔｕｍｏｌｅｃｕｌａｒｒｏｂｉｎｇｉｎｌｉｖｉｎｇｃｅｌｌｓ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆｔｈｅＡｍｅｒｉｃａｎＣｈｅｍｉｃａｌＳｏｃｉｅｔｙｐ，２０－１０１３２２７：％７４９２７６，（）ｅ－１６６ＭａＣＴａｎＺＷａｎＫｔａｌ．ＡｎｏｖｅｌｓｅｎｓｉｔｉｖｅａｎｄｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｉａｔｉｏｎｂａｓｅｄＡＴＰ［］，ｇ，ｇ，ｇ－ａｓｓａｙｕｓｉｎａｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｅａｃｏｎ．Ａｎａｌｓｔ２０１３１３８１０：３０１３３０１７ｇｙ，，（）１６７ＬｉｎＳＣｈｅｎＣＬｉｎＭｅｔａｌ．Ａｃｏｏｅｒａｔｉｖｅｅｆｆｅｃｔｏｆｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ［］，，，ｐｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓｏ打ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ：ｓｅｎｓｉｎｇａｌｋａｌｉｉｏｎｓｂｙｃｒｏｗ打ａ打ｄｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅｍｏ－ｉｅｔｉｅｓｉｎａｕｅｏｕｓｍｅｄｉａ．ＡｎａｌｔｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒ２００５７７１５：４８２１４８２８ｑｙｙ，，（）１６８］高淑丽，徐慧，鞠猜，等．基于焚光探针唾煙撥与核酸适体构象变化的钟离子［－检测．分析测试学报２０１１３０２：１１５１２０，，（）［１６９］吕菊波，徐平平，高淑丽，等．基于核酸适体构象变化的巧光钟离子检测．化－学通报：印刷版２０１３７６２：１６３１６６，，（）１７０］毕国明，高淑丽徐平平，等．基于纳米金超巧灭效应的光学押离子检测．环［，２０－境化学１５３１：１４４８１４４９，，巧）－５８－ 硕击学位论文附录Ａ攻读学位期间发表的学术论文＊－－－１ＣｈｅｎＬｉｗｅｉＬｉｕＸｉａｎＪｕａｎＫｏｎＪｉｎＹｕａｎ民ｕｉｎＹｕａｎｄＸｉａＣｈｕ．Ａ［］，ｇｇ，ｇ，Ｑｄｕａ－ｌａｍｐｈｆｉｃａｔｉｏ打ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｓｅｎｓｉｎｇｐｌａｔｆｏｒｍｆｏｒｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅａｓｓａｙｏｆ打ｕｃ—ｌｅａｓｅａｎｄＡＴＰｂａｓｅｄｏ打ｒｏｌｌｉ打ｇｃｉｒｃｌｅｒｅｌｉｃａｔｉｏｎａ打ｄｅｘｏ打ｕｃｌｅａｓｅＩＩＩａｉｄｅｄｐｒｅｃＵｎ２０－．ＲｓｃＡｄｖａｎｃｅｓ１５９２：＾０５５＾０６１．巧ｇ，，５（）＊－－Ｊ［２］ＴｉｎｇＴｉｎｇＣｈｅｎＸｕｅＴｉａ打ＣｈｅｎＬｉｗｅｉＬｉｕ，ｉａＧｅ，ＸｉａＣｈｕａｎｄＹｉｎｆｕＬｉ．，，ｇＦｌｕｏｒｅｓｃｅ打ｃｅＡｃｔｉｖａｔｉｏｎＩｍａｇｉｎｇｏｆＧｙｔｏｃｈｒｏｍｅｃＲｅｌｅａｓｅｄｆｒｏｍＭｉｔｏｃｈｏ打ｄｒｉａＵｓｉｎｇＡｐｔａｍｅｒｉｃＮａｎｏｓｅｎｓｏｒ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆｔｈｅＡｍｅｒｉｃａｎＣｈｅｍｉｃａｌＳｏｃｉｅｔｙ，２０１５，－１３７（２：９８２９８９．）３Ｙｕａｎ－Ｗｕ－－ＪｉｎＣｅ打ＹａｏＫｏｎＸｉａ打ＪｕａｎＳｈｕａ打ＣｈｅｎＬｉｗｅｉＬｉｕ民ｕｉｎＹｕ［］，ｇ，，ｇｇ，ｇ，Ｑ＊－－ＭｏｄａｎｄＸｉａＣｈｕ．Ｍｎ０２Ｎａ打ｏｓｈｅｅｔｉｆｉｅｄＵｐｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎＮａｎｏｓｙｓ化ｍｆｂｒＳｅ打ｓ－ＡｃｓｉｔｉｖｅＴｕｒｎ０打Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅ打ｃｅＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＨ２０２ａｎｄＧｌｕｃｏｓｅｉ打Ｂｌｏｏｄ．Ａ－ｌｉｅｄＭａｔｅｒｉａｌｓ＆Ｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ２０１５７１９：１０５４８１０５５５．，ｐｐ，（）－５９－ 基于滚环扩增和核酸外切酶ｍ辅助循环放大的島灵敏巧光生物传感器研巧致谢时光甚存一，岁月如梭，Ｈ年的硕±研巧生生活即将接近尾声。回首走过的千多个日子，感慨良多。初入湖南大学时的憧憬，刚进实验室的激动，埋头哨文一献的专注．．．．，认真实验时的充实，遇到挫折时的迷茫．．这切都历历在目。这Ｈ年是我成长的Ｈ年，体会了现实与理想之间的落差后，仍然勇敢地面对生活，热爱生活＂＂，不再畏惧未来任何未知的挑战；这Ｈ年是我收获的三年，在如堕烟海＂＂的论文和层出不穷的实验状况中，学会了透过现象看本质，抓取主要矛盾，分析问题和解决问题的能力得到了提升这Ｈ年更是我眷恋的Ｈ年，遇到了了美；好的爱情和友情一，经历了不样的生活，体会了人生的精彩纷呈。在硕±论文收笔之际！，我要感谢在我这Ｈ年研究生求学生涯中所有给进我帮助的人首先我要特别感谢我的导师楚霞教授。楚老师在科研和学术方面给了我悉也一丝不苟的工作作风的指导。她、严谨求实的治学态度Ｗ及坚初忘我的探索钻研精神！，都将使我终身受益。在此，谨向楚霞老师表达我最由衷的敬意特别感谢俞汝勤院±和沈国励教授，两位先生知识渊博、治学严谨、为人谦和、道德高尚，百忙之余仍不綴读书，不断探求，，；为人师表传道授业是我终生学习的榜样。感谢本小组的各位老师：蒋健巧教授、吴海龙教授、吴朝阳教授、宦双燕教授、陈增萍教授和周敬良、吴战等老师等，谢谢你们在我研究生学习中给我无私地指导和帮助！感谢实验室的博±陈婷婷、易姿、孔样娟、吴双、岑瑶、汤俊，潘青山，硕±李小艳、吴燕梅、乔海颖、田雪、洪美试、朱子貌、黄丽狡、韩慧霞、李丽娟、阳媛、胡超、易锦涛、李丽、赵艳艳、邓文婿等同学让我愉快地度过了Ｈ年的实验室学习时光！，感谢你们给我的帮助感谢亲爱的室友汲存满、袁静和李中文同学，在我失意时给我鼓励，在我失一落时给我支持！，我们起走过了Ｈ年的风风雨雨，你们美好了我的回忆特别感谢我的家人，谢谢父母的养育和栽培，谢谢你们无条件地支持和鼓励，谢谢你们的包容与关爱！，你们永远都是我最坚强的后盾和最温馨的港湾最后，再次感谢所有关也和帮助过我的老师、同学和朋友们，谢谢你们也祝福你们！刘陈力为２０１６年５月于湖南大学－６０－
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