基于酶切放大的高灵敏新型核酸荧光探针的研究

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基于酶切放大的高灵敏新型核酸荧光探针的研究目录学位论文原创性声明与学位论文版权使用授权书⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯I摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯IIAbstract⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．IV第1章绪论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯11．1生物传感器概述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．11．2花的衍生物在生化分析中的应用⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．11．2．1花的衍生物的概述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯11．2．2茈的衍生物的合成⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯21．2．3花的衍生物在生化分析中的应用⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯21．3各种酶的信号放大技术在生物分析中的应用⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯61．3．1基于核酸切割酶的信号放大技术⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯61．3．2基于DNA酶的信号放大技术⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．91．4本研究论文的构想⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯10第2章基于聚集态茈的衍生物作为高效无标记的广谱猝灭剂用于多目标生物的荧光检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯：⋯⋯122．1前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．122．2实验部分⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯132．2．1材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．132．2．2猝灭效率的研究⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯142．2．3用后添加方法进行核酸内切酶EcoRI活性的荧光检测⋯⋯⋯⋯⋯142．2．4用先添加方法进行核酸内切酶EcoRI活性的荧光检测⋯⋯⋯⋯⋯142．2．5多目标核酸内切酶活性的荧光检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．142．3结果与讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯152．3．1设计原理⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯152．3．2探针的优化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯182．3．3多目标检测核酸内切酶⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．192．3．4传感器的灵敏度⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．192．3．5传感器的选择性⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯202．4小结⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．21第3章多色荧光传感器用于多目标DNA的检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．223．1前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．223．2实验部分⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯23VII 硕士学位论文3．2．1材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．233．2．2DNA的检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．233．2．3多目标DNA的检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一243．3结果与讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯243．3．1设计原理⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．243．3．2实验条件的优化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．283．3．3酶切信号放大⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．303．3．4传感器的灵敏度⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．313．3．5传感器的选择性⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．353．4小结⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．36第4章DLISA：基于DNA酶的ELISA用于无蛋白酶的免疫分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯一374．1前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．374．2实验部分⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯384．2．1试剂与仪器⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯384．2．2衍生颗粒⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯394．2．3免疫分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．394．3结果与讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯394．3．1原理设计⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一394．3．2颗粒表征⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯404．3．3A矿浓度的优化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯424．3．4传感器的灵敏度⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．434．3．5传感器的选择性⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．444．3．6传感器用于多目标检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．454．3．7传感器用于实际样品的检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．474．4小结⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．48结j沦⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．49参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯51附录A攻读学位期间发表的学术论文目录⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．60致{射⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．61VIⅡ 硕士学位论文1．1生物传感器概述第1章绪论随着分析科学的不断发展，现代生化分析要求能够快速、高灵敏、高选择性和廉价地检测与生命活动相关的蛋白质、小分子以及环境污染物。正是在这些目标要求下，生物传感器横空出世。生物传感器是由生物分子识别元件与各类物理、化学换能器组成，可以用于分析和检测各种生命物质和化学物质。由于其具有选择性好、灵敏度高、成本低、操作简单、可用于实时监测等优点，在生物、医学、化学、食品、工业生产、环境监测及国家安全等学科和领域【l。3】有着广泛的应用。生物传感器一般由两部分组成：(1)生物分子识别元件(感受器)，是具有分子识别功能的生物活性物质，如组织切片、细胞、细胞器、酶、抗体、核酸、有机分子等。它在传感器中起着关键的作用，决定着传感器的灵敏度、选择性和可逆性。(2)信号转换器(换能器)，主要有光检测元件、电化学电极、热敏电阻、场效应晶体管、压电石英晶体以及表面等离子体共振器件等。根据这两个重要组成部分来划分，生物传感器有两种分类方式。根据生物分子识别元件的不同种类，它可分为酶传感器、DNA传感器、微生物传感器、免疫传感器、组织传感器、细胞传感器等；根据信号换能器种类的不同，它可分为生物电极传感器、半导体生物传感器、光学生物传感、热量生物传感器、电学传感器等。理想的生物传感器对目标物应具有高的灵敏度和特异性、宽的动力学检测范围、以及良好的通用性等特点【4】，而广谱猝灭剂和功能核酸的出现为生物传感器的发展提供了新的设计思路和平台。灵敏度是评价生物传感器性能的一个至关重要的因素。为了提高传感器的灵敏度，通常有两种方法：(1)降低检测背景；(2)采用信号放大技术。因此，本文将详细介绍广谱猝灭剂和功能核酸在生物传感器中的应用。1．2茈的衍生物在生化分析中的应用1．2．1茈的衍生物的概述花四酸二酰亚胺的衍生物(化合物1)，其结构如图1．1所示。由于其具有良好的光稳定性、热稳定性、高的荧光量子产率以及化学稳定性，无论是在工业染料和颜料的应用领域还是在学术研究中都受到人们的广泛关注。茈四酸二酰亚胺的衍生物最开始的时候主要是作为红色的染料应用于工业。直到20世纪50年代之后，由于其衍生物越来越多，并且都具有耐溶剂性、光稳定性、化学稳定性、良好的 基于酶切放大的高灵敏新型核酸荧光探针的研究分散性以及较强的着色能力，而被作为高级染料得到了更广泛的应用。二N^V^，+^v^一+、1图1．1化合物l的结构示意图近年来研究发现，具有大的n—n共轭电子结构的这类化合物表现了较好的光电性能，已经广泛应用于电子传输材料、电子照相、电致发光、太阳能电池以及生物荧光探针等领域。1．2．2j芭的衍生物的合成将花四羧酸二酐(PTCDA)和3．二甲胺基丙胺溶解于正丁醇中，在氮气保护下于90℃加热反应24h。将粗产物过滤，用去离子水和乙醇冲洗，将得到的残留物用5％的NaOH溶液于90℃下反应30min，除去未反应完的PTCDA。将悬浮液过滤，用水和乙醇清洗之后，在真空下干燥，得到红色固体。将得到的红色固体和碘甲烷加入到甲苯中，用氮气保护回流3h。待反应温度冷却到室温后，将粗产物过滤并且用乙醚洗涤，得到红棕色固体花的衍生物，即化合物1。化合物l合成路线诊J如1．2图所示。lSobutanOI+、’I：l一一、-一一、NH2———————I-．＼I：II90oCI岽}≥p————————---：N’V’reflux7八≮<^、一^N，I图1．2化合物1的合成路线1．2．3菲的衍生物在生化分析中的应用花的衍生物，由于其具有～个平面的芳香结构，所以与其他的菲四酸二酰亚胺衍生物一样容易通过芳香环的p-p堆叠而团聚，导致其很难应用于生物传感器。为了解决这个问题，Yu等【5】合成了一种带正电荷花的衍生物(化合物1)。由于化合物1含有两个正电荷，可以通过静电排斥作用降低自身的聚集倾向。因此，在水溶液中化合物l以单体形式存在并且显示出很强的荧光。因为DNA带负电荷，它能在静电相互作用下引起带正电荷的化合物1的聚集，由于分子间的强疏水性和化合物1分子之间的p．p堆叠，会将其荧光猝灭。化合物l在团聚前后荧光强 硕士学位论文度会发生改变，基于这点，人们发展了一些能简单、无标记、快速的荧光传感器，这些传感器能够用于小分子、蛋白质以及酶活性的检测。1．2．3．1菲的衍生物用于生物分子的检测生物分子在人类体内发挥着重要的作用。例如，生物体内普遍存在的调控系统，其中发挥主要作用的神经递质、激素、分泌物和细胞信号转导分子等，大部分都是生物分子。这些不同的生物分子在各种生命活动中承担着调节机体稳态的重要作用。因此，高灵敏的检测这些生物分子对很多疾病的早期诊断和治疗有着重要的意义。蛋白质是人体内重要的一种生物分子，它的定量检测在基础研究与临床实践中都是十分重要的。例如，Wang等【5】将核酸适配体和化合物1结合构建了一个荧光传感平台用于检测溶菌酶。如图1．3所示，由于静电吸附作用，带正电的化合物1可以吸附在带负电荷的溶菌酶的核酸适体上，化合物1的荧光被猝灭。当加入溶菌酶后，溶菌酶的核酸适配体与溶菌酶结合形成复合结构，使得化合物1从溶菌酶的核酸适配体上游离下来，以单体形式存在，从而荧光得到恢复，此方法可用于溶菌酶的检测并表现出很高的灵敏度。蹙》c。mp。und1aggregate啪．⋯刚川慨⋯一r＼3AotamerLysozyme图1．3基于化合物l和核酸适配体用于检测溶菌酶的原理示意图随后，Wang等【6】又发现聚集态的化合物1能有效地猝灭探针链上标记的荧光素(FAM)的荧光，且荧光猝灭效率达到了99．6％。如图1．4所示，PDGF的核酸适配体被分割成两半(FAM．apt，apt．2)。在核酸适配体的末端拉长6个碱基引入了一个限制性内切酶(切口酶Nt．BbvCI)的酶切位点。Nt．BbvCI能有效的识别双链DNA的特定序列并且切割其中一条单链。在有特定切割位点的DNA尾部标记了一个FAM荧光基团。加入化合物l后，由于化合物1在DNA上聚集，能有效的猝灭FAM的荧光。当没有PDGF存在时，两部分核酸适配体不能结合，Nt．BbvCI不能识别单链DNA。当有PDGF存在时，FAM．apt和apt一2会与PDGF结合，核酸适配体的末端会形成一个双链结构，此时，Nt．BbvCI切割特定的酶切位点，释 基丁．酶切放大的高灵敏新型核酸荧光探针的研究放出FAM基团，引起荧光信号增强。IlPDGF工r—j筹乙曼I——————’’．，l噶》rlI图1．4基于化合物l和核酸适配体用于检测PDGF的原理示意图1．2．3．2茈的衍生物用于金属离子的检测由于化合物1具有较好的水溶性、良好的光稳定性、热稳定性、高的荧光量子产率等特点，可将其与DNA相结合用于离子检测。0no小组最先报道了H92+可以特异结合胸腺嘧啶碱基(T)，并且可以使T．T错配碱基形成稳定的“T-H92+一T”结构【7。9】。随后，人们基于这种稳定的结构，设计了一系列的传感器用于水溶液中汞离子的检测。wang等[10】将化合物1与富T序列的DNA相结合构建了一个检测H矿+的生物传感器。化合物1可以吸附在富T序列的DNA上且荧光被猝灭。当加入H92+后，富T序列的DNA会与H92+结合形成“T-H92+．T”的稳定结构，将化合物1从探针链上释放出来使其荧光恢复，最后用于H矿+的检测并显示出很高的灵敏度。带正电荷的化合物1能有效的引起金纳米颗粒(AuNPs)的团聚从而引起溶液颜色的变化。AuNPs在Na+浓度为50mM或者M92+浓度为0．8mM时会引起AuNPs的团聚。但是如果用化合物1来代替时，只需要500nM就能使AuNPs团聚。尽管化合物1和M92+都有两个正电荷，但是化合物1引起AuNPs团聚的能力比Mg”强1600多倍。只需要10nM的化合物1就能引起AuNPs的紫外一可见吸收光谱的变化。基于这个原理，进而Wang等⋯】设计了一个基于纳米金的比色生物传感器用于检测H92+，原理示意图如1．5图所示。将富T序列与化合物1混合后，由于静电吸附作用会引起化合物1的聚集从而导致化合物1的单体荧光猝灭。当不存在H92+时，将AuNPs加入到溶液中，AuNPs不会团聚，溶液的颜色也不会发生变化。当存在H92+时，富T序列会与H92+结合成“T-H92+一T”的结构。化合物l从探针链上解吸附下来。此时，若加入AuNPs，游离的化合物l很容易吸附在AuNPs表面上。由于化合物1分子之间的p—p堆叠和疏水作用而吸附在AuNPs上将带负电荷的柠檬酸根离子中和，引起AuNPs的团聚。这种明显的紫外．4． 硕士学位论文一可见吸收光和颜色的变化为H92+的检测提供了一种更加快捷方便的方法。AB②⑨————————-—-一∞∞0000U————————-·一②⑨图1．5基于化合物l用于H92十检测的原理示意图1．2．3．3茈的衍生物用于酶活性的检测化合物l具有较好的生物兼容性，因此可将其用于酶活性的检测。S1核酸酶是一种高度单链特异的核酸内切酶，在最适的反应条件下，能够降解单链DNA或RNA，产生带5t_磷酸的单核苷酸或寡核苷酸。但是对双链DNA、双链RNA和DNA．RNA杂交体不敏感。Yang【121等基于化合物1构建了一个简单、快捷、无标记的、能实时检测S1核酸酶切割单链DNA活性的增强型荧光生物传感器。化合物1在水溶液中显示较强的单体荧光，加入单链DNA后，由于化合物l中带正电荷的铵离子和带负电荷的磷酸骨架之间的静电作用会引起化合物1的聚集从而引起荧光的猝灭。当不存在S1时，化合物1聚集荧光被猝灭。当存在S1核酸酶时，S1核酸酶将单链DNA切割成碎片，此时化合物1与单链DNA之间的静电吸附作用变得很微弱，化合物1游离出来引起荧光增强。具体的原理示意图如1．6所示。≯●，，，(’．)一，，(、一(、旦、一，广√)、＼，’’图1．6基于化合物l用于S1核酸酶活性检测的原理示意图 基于酶切放大的高灵敏新型核酸荧光探针的研究1．3各种酶的信号放大技术在生物分析中的应用灵敏度是衡量生物传感器性能好坏的一个非常重要的因素，所以提高传感器的灵敏度是十分重要的。通常提高传感器灵敏度有两种方法：降低背景信号和采用信号放大技术。其中，信号放大技术因为其能显著提高传感器的灵敏度而受到科研工作者的广泛关注，因而基于各种酶的信号放大策略成为近几年来生物传感器领域的研究热点。1．3．1基于核酸切割酶的信号放大技术1．3．1．1基于核酸内切酶的信号放大技术核酸内切酶(endonuclease)为可水解分子链内部磷酸二酯键生成寡核苷酸的酶。根据其识别序列的不同，可将核酸内切酶分为两大类：一是可以识别DNA的特异序列，并且在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶；另外一类为非限制性核酸内切酶，它是一种对切割的核酸序列没有要求的酶，如DNaseI，可以消化单链或双链DNA，并产生单脱氧核苷酸或单链或双链的寡脱氧核苷酸。限制性核酸内切酶可以识别特定的核酸序列并且将其切断，所以在重组DNA技术中占有十分重要的地位。近年来，一些科研者利用限制性核酸内切酶的这一特性设计了很多性能优越的DNA传感器【13小】。Xu等【13】将核酸切口酶与金纳米颗粒结合设计了一种DNA比色传感器。如图1．7所示，目标链DNA能与Linker链互补形成能被核酸切口酶NEase识别的序列。核酸切口酶NEase能识别特定序列的双链DNA，并且切割其中的一条链(Linker链)。当Linker链被核酸切口酶NEase切割之后，被切割的Linl(er链在高温下会自发的从目标DNA上分离下来。被释放的目标DNA又能继续与其他Linker链杂交，开始下一轮循环。当循环结束之后，加入两种纳米金颗粒，这两种纳米金颗粒表面修饰了能与Linker链完全互补的DNA。当没有目标DNA链时，Linker链与纳米金颗粒表面修饰的DNA杂交，纳米金颗粒会聚集，从而引起颜色的变化。当有目标DNA链时，Linker链被核酸切口酶NEase切割断，不能与纳米金颗粒表面修饰的DNA杂交，颜色不会变化，该方法测得的检测限为O．5fM。Kong等【14】提出了一种基于分子信标的“Y型”DNA探针，并且通过核酸内切酶(Nt．BbvCI)的信号放大技术来达到高灵敏、高选择性地检测目标DNA的目的。Liu等【15】还将该放大技术与电化学相结合用于DNA的检测，并得到明显的电流信号变化。 硕士学位论文人-，譬I。，：0／‘。、‘b_，b，—。^u-，L：图1．7基于核酸内切酶与金纳米颗粒相结合用于DNA检测的原理示意图另外，非限制性核酸内切酶也能用于生物传感技术并且实现信号的循环放大。Chen小组[17】将磁性石墨烯和标记有电化学活性物质的核酸适配体相结合构建了一种可以同时检测多个目标物的电化学生物传感器。当没有目标物时，DNA单链被吸附在磁性石墨烯上，避免受到核酸酶DNaseI的水解，此时传感器显示出很高的电化学信号。当有目标物存在的时候，目标物与相应的核酸适配体结合形成复合物，从磁性石墨烯上游离下来。失去保护的复合物会被核酸酶DNaseI切割将目标物释放出来。随后，被释放的目标物与磁性石墨烯表面上的其它核酸适配体相结合，并且诱发下一轮酶切反应。经过多次循环酶切后，大部分电活性物质远离电极表面最终导致电化学信号降低。具体的原理示意图如图1．8所示。0瑟．／一图1．8基于非限制性核酸内切酶的DNA传感器的原理示意图1．3．1．2基于核酸外切酶的信号放大技术核酸外切酶是一种可以从分子链的末端依次水解磷酸二酯键并且最终得到单核苷酸产物的酶。其在剪切修饰的过程中，总对单一核苷酸链作用，并且对DNA序列的特异性要求不高，因此在酶切信号放大方面具有更大的灵活性。核酸外切酶III(ExoIII)能够作用于双链DNA并且沿3’_5’方向逐步切割单核苷酸，它可以直接切割任意双链DNA的3’平齐末端或凹陷末端。科研工作者利用ExoIII的一一j．旷忙一薄一?≯∞。／．i7。。■，／＼、≮u^ 基丁．酶切放大的高灵敏新型核酸荧光探针的研究这一特性设计了一系列性能优越的传感器[18之21。zhao等【181将非标记的G四股螺旋DNA与ExoIII结合，提出了一种信号放大技术用于高灵敏地检测目标DNA。如图1．9所示，双链DNA探针中的一条链设计成能够形成G四股螺旋结构的富G序列。双链DNA探针的3’端都为突出端，由于ExoIll只能切割齐平的或者凹陷的3’端，所以这种设计可以确保探针链不被水解。N一甲基卟啉Ix(NMM)能与G四股螺旋结构的DNA结合，其自身的荧光非常弱，当与G四股螺旋结构的DNA相结合之后荧光剧烈的增加。此时，若加入NMM，由于NMM与双链DNA探针的作用力很弱，导致其荧光非常微弱。当加入目标链之后，目标链的5’端与双链DNA探针杂交形成有齐平3’端的双链DNA，此时ExoIII能从齐平的3’端水解探针链，释放出目标链和富G序列。释放出来的富G序列在一价离子的作用下形成G四股螺旋结构，与NMM相结合，荧光显著增强。而目标链又与其他的双链DNA探针结合，诱发下一轮循环。Zuo等【19]利用分子信标与ExoIII相结合，利用信号放大技术检测目标DNA。Willner小组【20]将ExoIII和量子点相结合构建了一种信号放大的荧光生物传感器用于多目标DNA的检测。≈／50．rJ⋯}3’≈3’／八RecvcIe＼／羊★。少—————’￥=NMM。=ExonucIease¨I图1．9基于核酸外切酶III的DNA传感器设计原理图核酸外切酶I(ExoI)能从3’_5’方向水解单链DNA，对DNA链的序列没有要求。近年来，人们利用ExoI这一特性设计了可用于离子、蛋白质和小分子的检测的生物传感器【23彩]。Zheng等[231构建了一种基于ExoI的非标记的荧光传感器，用于检测离子、蛋白质和小分子。Yuan等【24】将ExoI这一特性与“T．H92+．T”结构相结合构建了一个非标记的荧光传感器用于H92+的检测。如图1．10B所示，当不存在H92+时，ExoI将探针链水解；加入DNA染料之后，没有信号读出。当存在H92+时，H92+与探针链结合形成类似于发卡的双链DNA复合结构，阻止了ExoI对DNA探针的切割。此时加入DNA染料能够读到信号。 硕士学位论文一．：r州刚酋Y丁T9呵c1HrG÷cTAcTcTcATcATAcTcTGGr：B_!：：!_，G⋯}_：；，．!i】．，}：TTGTTTGTTGTGTTGTGTGTTGTTTGTGTCAu(a)|b)Ⅲ龟套岢恕一．o逆№哪。．图1．10几种基于核酸外切酶I的DNA传感器设计原理图1．3．2基于DNA酶的信号放大技术虽然蛋白酶的催化活性很高，可以用其构建一系列高灵敏度的生物传感器，但是因为蛋白酶不稳定，在高温或者高盐离子浓度下时容易失去活性，所以其应用范围也受到了限制。DNA酶是一种具有催化功能的单链DNA分子，由于它是一种脱氧核糖核酸，所以比蛋白酶更耐高温或耐高盐离子浓度，且它的合成成本比较低廉，所以DNA酶在信号放大技术中的应用前景是十分广阔的。DNA酶一般需要金属离子或小分子作为辅助因子才能催化酶切底物链。Zhao等【26】提出了一种基于基于DNA酶和氧化石墨烯的荧光增强型传感器用于Pb2+的检测。如图1．11所示，在底物链的一端标记了荧光基团(FAM)，底物链和酶链之间可以杂交，由于酶链的中间含有一段环形的单链DNA序列，所以底物链和酶链杂交成的探针可以吸附在氧化石墨烯上。当不存在Pb2+时，由于杂交探针的酶链上含有一段15个碱基的单链DNA，使得它和氧化石墨烯之间有很强的结合力，从而导致底物链上的荧光基团与氧化石墨烯的距离很近，荧光基团的荧光被猝灭。此外，没有与酶链杂交的底物链也可以通过7【．兀堆积作用吸附在氧化石墨烯上，使其荧光被猝灭。因此该设计为传感系统提供了很低的背景荧光。当存在Pb2+时，会辅助DNA酶产生催化活性，将底物链切割为两部分。被切割成的两段短的底物链从酶链上游离下来。被释放出的酶链继续与其他的底物链杂交，诱发下一轮循环，最终产生很多含有FAM的短DNA链。此时加入氧化石墨烯，由于短链DNA与氧化石墨烯结合力很弱，FAM标记的那段短DNA不会吸附在氧化石墨烯上，荧光不会被猝灭。一冒‰。一回。。一督p少～p 綦丁二酶切放大的高灵敏新型核酸荧光探针的研究(a)3’。TT宁千TA宁}宁}AGG．TcA}。FAM．5．(c)一—《5’．A^1(：ATCT('+7^(；’e·3’(b)3’·AGTAGAGAAGGrATcAc-FAM·5II·I5’··3’、ltNoPb，=彳尹秘c壬孓。—了厂。L。亡：壬io-P矿＼，a面每夕—弋厂J)图1．11基于DNA酶信号放大技术的DNA传感器设计原理图Zhang等P7J提出了一种新型变构DNA酶用于腺苷的放大检测。如图1．12所示，Mg。2+依赖的DNA酶被设计成由腺苷的核酸适配体主导的I部分和起催化作用的II部分。此时的DNA酶不具有催化活性。当目标腺苷不存在时，DNA酶即使在M92+的存在下也不能形成一个稳定的活化的结构催化切割发夹型结构的底物链。当加入目标腺苷时，DNA酶I部分的核酸适配体能够识别并结合腺苷形成一个紧凑的结构激活了酶链的催化活性。此时，酶链在在辅助因子M92+的作用下催化水解发夹型结构的底物链，释放出荧光基团标记的DNA链，从而引起荧光的显著增强。随后，酶链又能与未参加反应的底物链杂交进行下一轮的信号放大。Sun等【28】还将DNA酶的信号放大技术与电化学相结合设计了一种电化学生物传感器用于腺苷的检测，其检测限为50fM。‘引气户(b’，·。6‘。；一’‘17c·．．舢咤一”、曩_心PUnh．bnedDNAzymeAcliV砒edDNAzyme图1．12基于DNA酶信号放大技术的传感器设计原理图1．4本研究论文的构想在广泛查阅关于荧光生物传感器的文献的基础上，结合本实验室已有的相关科研结果，为了提高传感器的灵敏度，本论文基于聚集态花的衍生物高的猝灭效率、核酸外切酶III和DNA酶的信号放大技术，设计了一系列的高灵敏度、容易操作、成本低的生物传感器用于蛋白质、DNA的检测。本论文主要包括以下几个方面： 硕士学位论文(1)利用聚集态的花的衍生物能高效猝灭各种标记在DNA上的荧光基团的荧光的特性，构建了一种基于聚集态茈的广谱猝灭剂用于多目标检测酶活性的荧光传感器。该传感器具有灵敏度高、成本低、设计简单、易操作且不需要双标记等优点。(2)基于聚集态花的衍生物高的荧光猝灭率和核酸外切酶III的信号放大技术构建了一种能高灵敏的多目标检测DNA的荧光传感平台。核酸外切酶III的信号放大作用大大增加了传感器的灵敏度。此外，由于聚集态茈的衍生物具有较好的生物兼容性以及高的稳定性，不会影响生物分子的活性，所以该生物传感器能使用“后添加”的方法进行实时检测。所以，该传感平台在快速检测多目标生物分子方面具有广大的应用前景。(3)利用DNA酶的循环放大作用及ELISA构建了一种无蛋白酶标记的、三重信号放大的DLISA荧光生物传感系统用于多目标蛋白的检测。在实验设计中，通过阳离子交换的方法将目标物进行信号放大，进而利用DNA酶的循环放大作用，使得该传感系统显示出很高的灵敏度。此外，由于该传感系统没有采用蛋白酶进行检测，因此大大提高了检测系统的稳定性。因此该传感系统具有高灵敏度、选择性好、成本低、稳定性能好的优点，具有较好的通用性，在免疫分析和临床诊断中具有较好的研究价值。 基于酶切放大的高灵敏新型核酸荧光探针的研究第2章基于聚集态茈的衍生物作为高效无标记的广谱2．1前言猝灭剂用于多目标生物的荧光检测荧光方法具有独特的优势，如高灵敏度，具有快速的空间分辨率，而且对样品和细胞的损害比较小【29。32】。在过去十几年中，人们越来越关注荧光传感系统用于生物分子检测的发展。大多数的传感系统都由一个无荧光的猝灭剂来猝灭荧光基团的荧光。迄今为止，最常用的商业猝灭剂就是有机小分子。然而，有机小分子通常需要通过复杂的修饰过程连接在探针上，猝灭效率比较低，并且对发射波长不同的荧光基团猝灭效率不同133’3引。在最近几年，各种纳米材料，包括可以高效猝灭各种荧光基团的碳纳米材料和纳米金颗粒(AuNPs)得到了很大的发展【26'35’37】。例如，有报道称金纳米颗粒(AuNPs)对荧光素(FAM)的猝灭效率比有机猝灭剂对FAM的猝灭效率高100倍13引。然而，这些以金纳米颗粒为基础的方法通常具有差的盐稳定性和热稳定性，从而限制了它们的实际应用【38，391。还有报道指出，碳纳米管(CNT)和石墨烯能有效地猝灭不同荧光基团的荧光。但是，蛋白质和生物分子很容易非特异性地吸附在碳纳米管或石墨烯上面，这样在一定程度上可能会抑制这些生物分子的活性【4叭。Chen等人通过将一系列的猝灭剂装入介孔二氧化硅纳米颗粒(MSN)里面作为广谱猝灭剂【4l】，这个广谱猝灭剂可以有效地猝灭发射可见光和近红外(NIR)光的荧光基团。为了获得这样的纳米猝灭剂，需要一系列复杂的准备步骤。因此，发展一种容易合成的，具有高猝灭效率的，好的生物相容性的和稳定的广谱猝灭剂是急需解决的一件事情。近年来，据报道称聚集态的阳离子芄四羧基二酰亚胺衍生物(化合物1)能够充当超级猝灭剂猝灭相邻的寡核苷酸上标记的FAM荧光基团【6，4引。这种超级猝灭剂可以通过一种无标记过程在原位形成，这使得它成为一种有吸引力的，普遍和方便的猝灭剂来构建FAM荧光生物传感器。在这项工作中，我们第一次报道了阳离子聚集态的芄的衍生物(化合物1)可以作为一种无标记的广谱淬灭剂，其能够通过强静电相互作用有效地猝灭带负电荷的寡核苷酸上面标记的发射波长从520IuIl到670啦的各种荧光基团的荧光。与经典的有机小分子猝灭剂相比，化合物1是一种能够通过强烈的静电相互作用有效地猝灭标记在寡核苷酸上的一系列发射波长范围从可见光到红外区域的荧光基团的荧光的无标记的猝灭剂。它 硕士学位论文不需要通过繁琐的步骤修饰在探针上。在本文中我们选择核酸酶作为生物分子模型。利用这样一种广谱猝灭剂通过采用无标记和后添加的方式来构建一个多目标分析平台，并且达到了令人满意的结果。(a}一?，E‘o⋯“扩⋯‘亨一萋善厂。一0L—T毒xjsRedDNAp夕j≯·，、蚕乏CyS图2．1(a)化合物1对各种荧光染料的猝灭特性的示意图。荧光基团的荧光被化合物1猝灭。(b)基于阳离子聚集态菲的广谱猝灭剂用于核酸酶的多目标生物分析平台的原理示意图。以FAM和TAMRA荧光基团标记的核苷酸为模型用于核酸酶EcoRI和EcoRV的检测。FAM和TAMRA的荧光能被聚集态的化合物1猝灭，当加入核酸酶EcoRI或者EcoRV时，核苷酸双链被剪切，释放出FAM或TAMRA相连的短的核苷酸片段，其荧光信号被恢复。2．2实验部分2．2．1材料实验所用寡核苷酸链均由生工生物技术有限公司(上海，中国)合成，其序列见表2．1。限制性核酸酶EcoRI，EcoRV和NEBbuf．fer3购于纽英伦生物技术北京有限公司(中国，北京)。花四羧酸二酐和N，N一二甲基一l，3一丙二胺均购买自阿法埃莎公司。碘甲烷和其他化合物购自上海化学试剂有限公司(上海，中国)。所有试剂均为分析纯，未经进一步纯化使用。实验用水均为Millipore系统纯化的超纯水(电阻系数大于l8．2MQ·cm)。MV队以k● 基于酶切放大的高灵敏新型核酸荧光探针的研究表2．1实验中所用DNA的序列3．FAM．AFAM．CTGAATTCTGGATGTAGTTAGTAGTC3．FAM．BGACTACTAACTACATCCAGAATTCAG5．FAM．AFAM-CACTGAATTCTGGATGTAGTTAGTAGTC5．FAM．BGACTACTAACTACATCCAGAATTCAGTG7．FAM．AFAM—CTCACTGAATTCTGGATGTAGTTAGTAGTC7．FAM．BGACTACTAACTACATCCAGAATTCAGTGAGTA．ATA．BTE．ACy5-ATAMRA—CAGATATCGTTAAGTAGGTGCATGTGTCGACACATGCACCTACTTAACGATATCTGTbxasRed．ATGAAGGACGATGTATGCTTGAGGTCCy5·CAGATATCGTTAAGTAGGTGCATGTGTC本实验体系所用荧光检测仪器为带有控温(精确至0．1℃)装置的FluoroMaX．4荧光分光光度计。所有检测均在室温环境(T=25℃)下完成。2．2．2猝灭效率的研究首先将不同浓度的化合物1和含有各种荧光基团标记的DNA(10pL，1pM)的溶液混合加入到缓冲溶液中(50mMTris-HCl，100mMNaCl，10mMMgCl2，1mMDTT，pH7．9)。反应10min之后，在FluoroMax一4荧光分光光度计上进行荧光检测。2．2．3用后添加方法进行核酸内切酶EcoⅪ活性的荧光检测核酸内切酶EcoRI活性的荧光检测是在含100nM5一FAM．A，loonM5．FAM．B的缓冲液(50mMTris—HCl，100mMNaCl，10mMMgCl2，1mMDTT，pH7．9)中进行的。在室温下反应lOmin后，加入化合物1(8pL，30pM)到上述混合物中。10min后，将不同浓度的核酸酶EcoRI加入到样品溶液中，待在370C反应1h后测定其荧光值。2．2．4用先添加方法进行核酸内切酶EcoRj活性的荧光检测在含100nM5．FAM．A，100nM5．FAM．B的缓冲液(50mMTris．HCl，loomMNaCl，10mMMgCl2，lmMDTT'pH7．9)中加入不同浓度的核酸酶EcoRI，在37。C下反应1h。将化合物l(8“L，30pM)加入上述反应液中，10min后测定其荧光值。2．2．5多目标核酸内切酶活性的荧光检测将16pL30pM化合物1加入到含150nM5一FAM-A，l50nM5一FAM-B，100．14． 硕士学位论文nM1’A．A和100nM1’A．B的缓冲溶液(50mMTris—HCl，100mMNaCl，10mMMgCl2，1mMDTT，pH7．9)中，反应10min后，加入0．3U／“L限制核酸内切酶EcoRI和O．2U／pL限制核酸内切酶EcoIW。在37℃下继续反应l小时后，测定FIAM(激发波长：494mn，最大发射波长：508I姗)和TAMRA(激发波长：559啪，最大发射波长：580nm)荧光基团的荧光值。2．3结果与讨论2．3．1设计原理为了证明猝灭剂的广谱猝灭能力，我们首次研究了聚集态的茈衍生物1对寡核苷酸上标记的不同发射波长的荧光团荧光的猝灭效率。如图2．2所示，随着加入化合物1浓度的增加，所有荧光基团的荧光强度逐渐下降。聚集态化合物l对各种荧光基团最终的猝灭效率分别为：FAM为98．3％，TAMRA为97％，TexasRed为98．5％，Cy5为98．2％。猝灭剂与染料标记的DNA非共价相互作用。由于单链DNA是一种聚阴离子化合物，带正电的花衍生物1与聚阴离子的DNA之间的强静电相互作用会导致化合物1快速与标记了染料的寡核苷酸结合，形成聚集态的化合物l。所以我们可以推断，标记了荧光团的DNA荧光的猝灭是通过分子间的强疏水性和聚集态化合物l与荧光团之间的Ⅱ．Ⅱ堆叠来发生的。聚合化合物1的猝灭效率比所报道的纳米金颗粒和碳纳米管的猝灭效率(90％)高得多。实验中还考查了金属离子对传感系统的影响。如图2．3所示，我们可以看到，金属离子对传感系统的没有显著的影响。聚集态化合物l对荧光的猝灭速度相当快，将化合物1加入到传感系统中几分钟之后荧光基团的荧光几乎能全部被猝灭，如图2．4所示。此外，寡核苷酸与化合物1之间的自组装也具有较好的热稳定性。所有这些独特的性能使得聚集态化合物1成为了一种可以通过无标记的方法构建多目标生物分析的平台的较理想的猝灭剂。 綦于酶切放大的高灵敏新型核酸荧光探针的研究al罩6·+6j5e+6蚺盎4H6Ci39+6U旨2e+6∞竺1·+sO星o(c)j日墨丽墨董∞呈器曼宝正【FAⅦ(blj蠢i=nC2三of，1、＼、＼‘TexasR1{2}＼、号星空∞番芒=苎器乏。呈uI580600620640Wavelength(nm)【Cy5】6eO680700720740760WaVeIength(nm)图2．2标记了不同的荧光基团的DNA在加入不同浓度的化合物l之后的荧光发射光谱图。(a-c)：(1)0，(2)0．1，(3)O．2，(4)0．3，(5)O．4，(6)0．5，(7)0．6，(8)0．7，(9)0．8，(10)0．9，(11)1．0，(12)1．1，(13)1．2¨M；(d)(1)0，(2)0．25，(3)O．5，(4)0．75，(5)1．0，(6)1．25，(7)1．50，(8)1．75，(9)2．0，(10)2．25，(11)2．50，(12)2．75，(13)3．0肛M。所有带标记的单链DNA的浓度为100nM。【a)FAM(b)TAMRA№nk^13+Pb2．cu2．z-'2．F·3．F·2．^，c，+co斗““Ha扣comp训n6d)Cy5图2．3金属离子对传感器的影响。(a．c)金属离子的浓度为20肛M，化合物1的浓度为2uM。(d)金属离子的浓度为40肚M，化合物1的浓度为4“M。Fo为加入金属离子之前传感器的荧光强度，F为加入金属离子之后传感器的荧光强度。．．16．一 硕士学位论文图2．4加入化合物l之后，标记了FAM荧光基团的探针链的荧光实时响应图。为了验证我们的设想，我们选择了核酸内切酶作为多目标分析平台的生物分子模型。设计原理如图2．1b中所示，分别设计了标记了FAM和TAMRA的有特定酶切位点的寡核苷酸，将其作为检测核酸内切酶EcoRI和EcoRV的模板。当不存在核酸内切酶时，DNA上标记的荧光基团的荧光被猝灭。我们发现，当pH=7．9时，FAM标记的单链和双链DNA都能引起化合物1的聚集，从图2．5和2．6可以看出，它们的猝灭效率是相近的。当加入核酸内切酶时，会切割寡核苷酸上面特定的酶切位点，释放出一段较短的连接有荧光基团的DNA。因为这段标记有荧光基团的寡核苷酸只有5个碱基，只能结合少量的化合物1，因此，化合物1对荧光基团的荧光猝灭比较微弱。随着所加入的核酸内切酶的浓度增加，荧光强度将逐渐增强。图2．5加入不同浓度的化合物1时，FAM标记的双链DNA的荧光响应图。所加入的化合物l浓度为：(1)0，(2)O．3，(3)O．6，(4)0．9，(5)1．2，(6)1．5，(7)1．8，(8)2．1，(9)2．4¨M。双链DNA的浓度为100nM。 基于酶切放大的高灵敏新型核酸荧光探针的研究图2．6加入不同浓度的化合物1时，TAMRA标记的双链DNA的荧光响应图。所加入的化合物l的浓度为：(1)0，(2)0．6，(3)1．2，(4)1．8，(5)2．4，(6)3．0，(7)3．6，(8)4．2，(9)4．8¨M。双链DNA的浓度为100nM。2．3．2探针的优化为了使该系统达到最佳的检测效果，我们首先优化了DNA上的酶切位点与FAM标记端之间的碱基长度，具体见图2．7。当切割之后产生的DNA片断上的碱基对过长时，由于化合物1会在DNA片段上聚集，导致传感系统的荧光恢复较弱。从图中可以看出，当FAM端距离酶切位点有5个碱基的长度时，荧光恢复的信背比较7个碱基长度的时候更强。当标记FAM的一端离酶切位点只有3个碱基长度的时候，信背比也比较低。这是因为碱基长度太短，发生酶切作用时将会有空间位阻，从而降低酶切效果。因此，我们在实验中选择FAM端距切割位点为5个碱基时作为最佳的反应探针。与碳纳米材料相比较，我们的广谱猝灭剂还具有另一个显著优点，它不会影响核酸酶的活性。如图2．7所示，先添加与后添加的方法(先添加方法：待酶切反应全部完成之后再加入猝灭剂化合物1；后添加方法：在酶切反应之前就将化合物1加入)对酶切产生的荧光恢复的信背比没有明显的差别。与先添加方法相比较，后添加的方法较简单，容易操作，并能对目标物进行实时监测。图2．7FAM标记端离酶切位点碱基对长度对传感器响应性能的影响。3．FAM，5一FAM，7．FAM分别表示酶切位点离FAM端的碱基对长度分别为3，5，7。黑色棒状图：后添加方法；灰色棒状图：先添加方法。矾：巨一㈣㈣㈨一：蓥㈨M。aj一吾lec．芑一。uc．_￡onl也 硕士学位论文2．3．3多目标检测核酸内切酶W●V一●ngth(nm)fc)图2．8(a，b)只添加一种核酸内切酶，传感器的荧光响应性能。(c)当加入两种核酸内切酶时，传感器的荧光响应性能。两种核酸内切酶的浓度分别为：300U／mL的EcoRI，200U／mL的EcoRV。在最佳的实验条件下，我们将上述两种DNA探针通过后添加的方法来进行核酸酶的多目标分析。首先，将两种探针混合在同一个溶液中。我们可以推断，加入的一定量的核酸酶将切割相对应的探针，引起相应荧光团(FAM和TAMRA)的荧光增强。图2．8a所示的现象证明了该平台能有效的检测单个核酸酶。当加入EcoRI时，FAM标记的探针将被切割成两部分，此时，FAM的荧光增强。同时，TAMRA的荧光没有增强。这个现象表明了可以忽略两个核酸酶之间的交叉干扰。实验中用同样的方法特异性检测EcoRV核酸酶的活性，见图2．8b。实验中还同时检测了两个核酸酶的活性。当同时加入EcoRI和Ec01w两种核酸酶到混合溶液中后，从图2．8c中我们可以看出FAM和TAMRA的荧光都增强。由此表明该平台是可以用于多目标同时检测核酸酶的。2．3．4传感器的灵敏度(a1图2．9(a)传感器中加入不同浓度的EcoRV核酸内切酶时的荧光光谱图。(1)0，(2)O．1，(3)O．5，(4)1．0，(5)4．O，(6)6．0，(7)10，(8)50，(9)100，(10)200，(11)400，(12)500U／nlL。(b)检测EcoRV核酸内切酶的传感系统的校正曲线，插图为传感器对低浓度的EcoRV核酸内切酶的校正曲线。 基丁酶切放大的高灵敏新型核酸荧光探针的研究520S柏5∞580∞0WaVeIe咽th(nm)图2．10(a)传感器中加入不同浓度的EcoRI核酸内切酶时的荧光光谱图。(1)0，(2)O．1，(3)0．4，(4)0．6，(5)1．0，(6)6．O，(7)10，(8)30，(9)50，(10)100，(11)400，(12)600u／mL。(b)检测EcoRI核酸内切酶的传感系统的校正曲线，插图为传感器对低浓度的EcoRI核酸内切酶的校正曲线。实验中还对传感系统的灵敏度进行了考查。图2．9是传感器在检测不同浓度的核酸酶EcoIW时的荧光光谱图。从图2．9a可以看出传感器的TAMRA的荧光强度随着EcoRV浓度的增加而增加。当EcoRV的浓度从O．1U／mL增加至500U／mL时，TAMRA的荧光强度逐渐增强。荧光强度与EcoIW浓度之间的关系如图2．9b所示，经计算可得到其检测下限为0．03U／mL。这个较低的检测下限比之前报道的荧光检测的下限低得多[43，441。该传感器用于检测核酸内切酶EcoRI的时候也能达到相似的高灵敏度，检测下限为O．05U／mL，见图2．10。2．3．5传感器的选择性‘‘oRIE‘口RV眦～wIm．BbvCI(b)1·21·●·●r、o．·芷J·20．●———J_L■■■■■■一图2．1l(a)传感系统中加入不同种类的核酸内切酶时在518nm处的荧光响应图。各种酶的浓度分别为：10U／mLEcoRI，100U／mLEcoRv，100U／mLNt．A1wI，100U／mLNt．BbvCI。(b)传感系统中加入不同种类的核酸内切酶时在583nm处的荧光响应图。各种酶的浓度分别为：1OU／mLEcoRV100U／mLEcoRI，100U／mLNt．AlwI，l00U／mLNt．BbvCI。如图2．11所示，为了检验传感系统的选择性，我们考察了其他非目标核酸内一jj||||||=||||l||j||||0|| 硕士学位论文切酶(如Nt．AlwI，Nt．BbvCI)的荧光响应。从图中可以发现，非目标核酸酶的荧光响应与空白样品的几乎相同，而对目标核酸酶有一个强烈的荧光响应。上述结果表明，该方法对核酸内切酶EcoRI和EcoRV具有很好的选择性。2．4小结在本章中，我们第一次报道了聚集态花的衍生物1可以作为一种无标记的广谱猝灭剂，能有效地猝灭一系列标记在DNA上面的荧光基团。这种广谱猝灭剂可以通过无标记的方法来构建一个多目标生物分析平台，本文中我们选择了核酸酶作为生物分子的模型。利用聚集态茈的高猝灭效能，使得对核酸酶的检测达到了一个较高的灵敏度，EcoRI的检测下限为0．05U／mL，EcoRV的检测为0．03U／mL。由于这个传感器可以采用后添加的方法进行，所以可以在均相溶液中同时检测多目标核酸内切酶。更重要的事，聚集态花的衍生物作为猝灭剂具有一些独特的优点：无需标记，良好的生物相容性，对各种荧光基团都有高猝灭效率，并且不会影响酶的活性。因此，聚集态花可以作为广谱猝灭剂广泛的应用于构建基于寡核苷酸的多目标生物分析平台。 基于酶切放大的高灵敏新型核酸荧光探针的研究第3章多色荧光传感器用于多目标DNA的检测3．1前言随着生物医学的发展，开发出一种灵敏度高、能快速检测特定DNA序列的方法对重大疾病的早期检测是有必要的。与药物代谢的个体差异性一样【48491，如果插入或缺少了某些突变寡核苷酸就会诱发某些癌症和一些基因疾病【45-471。荧光分析法由于具有操作简单、成本低、灵敏度高、分析速度快以及对样品和细胞的损伤小等优点，已经被广泛应用于各种生物分子的检测【2钆32l。在过去的十年中，设计荧光生物传感器用于寡核苷酸的检测引起了更多的关注【50。52】。大多数的生物传感器是基于无荧光的猝灭剂设计的，这就赋予了这种生物传感系统具有很高的灵敏度。到目前为止，最常用的商业荧光猝灭剂是有机小分子。然而，它们一般需要通过繁琐的步骤修饰在探针上面，并且它们存在灵敏度低，不稳定，对不同波长的荧光基团猝灭效率低的缺点【33’34】。已报道的包括碳纳米材料和金纳米颗粒(AuNPs)在内的各种纳米材料的猝灭剂已经具有较高的猝灭效率f26，35，37，531。例如，AuNPs对FAM基团的猝灭效率比有机猝灭剂高100倍13引。此外，基于AuNPs的方法通常呈现出较差的盐稳定性和热稳定性，因此限制了其实际应用【3歌39J。碳纳米管(CNTs)和石墨烯也能有效的猝灭不同类型的染料。然而，蛋白质和其他生物分子会吸附在碳纳米管和石墨烯上面，这样在某种程度上会抑制这些生物分子的活性【40，54．55】。Chen等人通过将一系列的猝灭剂嵌入介孔硅(MSNs)中而制得一种广谱猝灭剂【4¨。这种广谱猝灭剂能有效地猝灭较宽波长范围的可见光和近红外(NIR)光。但是，得到这种猝灭剂需要经过一系列复杂的合成过程。因此，发展一种容易合成的、具有高猝灭效率的、有较好生物兼容性和稳定性的广谱猝灭剂具有极其重要的意义。茈酰亚胺的衍生物由于其具有高的荧光量子产率和光稳定性、高的热稳定性以及好的化学惰性，已经被用作一种优良的荧光团【5】。据报道，阳离子花酰亚胺衍生物(化合物1，如图3．1中所示)在水溶液中能够显示出很高的单体荧光，当加入单链DNA(ssDNA)时，能与ssDNA聚集，引起荧光的有效猝灭【561。当在寡核苷酸上聚集时，化合物l可以有效地猝灭一系列发射波长从可见光区到红外光区的荧光。因此，聚集态的化合物1能作为一种广谱猝灭剂。这种广谱猝灭剂可以通过无标记的方法构建多目标DNA检测的多色荧光传感器。聚集态的化合物1对传感系统中标记在ssDNA上的荧光基团的荧光有较高的猝灭效率，使得传感系统具有荧光背景低且检测下限低的特点。 硕士学位论文核酸外切酶III(ExoIII)对DNA序列没有特异性要求，不需要特定的识别位点。它能够作用于任意双链DNA(dsDNA)的3。平齐末端或凹陷末端，并且沿着3，_÷5，方向逐步催化取出单核苷酸【57’601。因此，基于ExoIII自催化目标循环放大也被融入了传感系统。目标DNA与探针链杂交形成dsDNA，此时，dsDNA被ExoIII切割，并且释放出目标DNA。被释放出的目标DNA又继续与探针链结合引发下一轮循环，将荧光信号放大【601。高猝灭效率和自催化目标循环放大使目标DNA的检测具有高灵敏度，检测下限为20pM。这与传统的无荧光放大分析方法相比低了50倍。此外，这个传感器能很好的区分完全互补配对链与错配链。我们利用这个传感系统，使得在均相溶液中同时、多目标分析检测几种DNA的想法得以实现。进一步证明了其在多目标快速生物分析中具有潜在的应用价值。除此之外，由于我们的设计是通用的，所以这个传感器也可用于其他目标DNA的分析检测。3．2实验部分3．2．1材料实验所用核酸链均由生工生物技术有限公司(上海，中国)合成，其序列见表3．1。花四羧酸二酐和N，N一二甲基一1，3一丙二胺均购买自阿法埃莎公司。碘甲烷和其他化合物购自上海化学试剂有限公司(上海，中国)。核酸外切酶III购于纽英伦生物技术北京有限公司(中国，北京)。所有试剂均为分析纯，未经进一步纯化使用。实验用水均为Millipore系统纯化的超纯水(电阻系数大于18．2MQ·cm)。如果没有特别说明，所有测量均在室温下进行。表3．】实验所用核酸探针序列DNA序歹U(5’_÷3’)FAM．CTGAATTCTGGATGTAGTTAGTAGTCGACTACTAACTACATCCAGAATTCAGTGAGTAMRA—CAGATATCGTTAAGTAGGTGCATGTGTCGACACATGCACCTACTTAACG—LTATCTGAGCGCv5．CTAGTTCTAAGTTCTGATCGATCGTAGCGCTACGATCGATCAGAACTTAGAACTAGAATGGACACATGCACCTACTTACCGATATCTGAGCGGACACATACACCTACTTCACGATATCTGAGCG3．2．2DNA的检测实验首先将100nM的TAMRA标记的探针DNA、14“L1O肛M的化合物1在l2345PTPTPT 基于酶切放大的高灵敏新型核酸荧光探针的研究室温下混合。10min之后，将不同浓度的目标DNA、4U的ExoIII加入到样品溶液中，在37℃下温育反应0．5h。反应在100“L1×NEBbu虢r1(10mMBisTris丙烷．HCl，10mMMgCl2，1mMDTT，pH7．0)中进行。用FluoroMax．4荧光分光光度计记录583nm处荧光强度的变化。3．2．3多目标DNA的检测将FAM标记的探针DNA(P1)，TAMRA标记的探针DNA(P2)，Cy5标记的探针DNA(P3)以及14此lOpM的化合物l在室温下混合均匀。10min之后，将DNA样品和4U的ExoIII加入到混合溶液中，37℃下温育反应0．5h。用FluoroMaX．4荧光分光光度计记录荧光强度的变化。3．3结果与讨论3．3．1设计原理我们构建了一个可用于简单、灵敏、多目标检测目标DNA的分析检测平台。设计原理如图3．1所示，在探针DNA(P1，P2，P3，它们各自的目标DNA分别是T1，T2，T3)的5’端分标标记了FAM，TAMRA或Cy5，当加入PDI之后，化合物1聚集在探针链上并且猝灭荧光基团的荧光，此时ssDNA上标记的荧光基团的荧光很微弱。当加入目标ssDNA之后，荧光基团标记的探针DNA与目标DNA杂交，探针链的3’端与目标链完全杂交，但是目标链的3’端有4个碱基没有与探针链杂交。由于只有双链的3’平齐末端或者凹陷末端才能被ExoIII切割，所以，形成的双链DNA可以被ExoIII从探针链的3’端开始切割，最后释放出目标DNA以及荧光基团。被释放出的荧光基团由于不再被聚集态的化合物l猝灭，荧光强度增强；而释放出的目标DNA又能与其他荧光基团标记的探针DNA结合，从而引发下一轮的酶切循环。一个目标DNA链可以引发切割大量的探针DNA，使荧光强度逐渐增强，从而可以高灵敏地检测目标DNA。因此，当使用不同探针与相应的荧光基团时，可以得到一个在均相溶液中同时进行多目标DNA分析的多色传感器。 硕士学位论文HIghfIuoresct嗽eBroad-spectrumQuencher．?沁一‘碱黧害Ex。．．．夕H；gh确曩矽饿—V罴衫≮-图3．1基于核酸外切酶III和化合物l相结合用于DNA放大检测的原理示意图。首先，我们研究了聚集态的化合物1对标记在ssDNA上的荧光基团荧光的猝灭能力。如图3．2a所示，当将化合物l加入到FAM、TAMRA、Cy5标记的ssDNA(P1，P2，P3)中时，荧光被猝灭。在1．2“M的化合物1溶液中，超过98％的FAM的荧光被猝灭。聚集态的化合物1对ssDNA上标记的F．AM、TAMRA、Cy5荧光基团的荧光的猝灭效率分别达到了98．3％士0．9％，97士1．1％和98．2％士0．6％。这个结果证明了聚集态的化合物1能有效地猝灭标记在ssDNA上的荧光基团的荧光。此外，如图3．2b所示，只需要2min，荧光强度即可达到一个稳定的数据，这表明化合物l在ssDNA上能快速地聚集，并且能快速有效地猝灭荧光基团的荧光。蛳。>手心、§、～)每心●．毫．．州器俨=盯OUouqCn蛳)>、啪、罗、撇)专枷◆ 堆于酶切放大的高灵敏新型核酸荧光探针的研究图3．2(a)不存在(红色)与存在(黑色)化合物1时，100nM的P1(左)、P2(中)、P3(右)的荧光图。(b)100nM的Pl、P2和P3在加入1“M化合物l之后的荧光实时响应图。100nMP1链(c)和P2(d)的Lineweaver_Burk点线图。Fo和F分别表示加入化合物1前后的荧光基团的荧光强度图。P1的数据记录的是激发波长为494nm，发射波长为518nm时的荧光。P2的数据记录的是激发波长为559nm，发射波长为583nm时的荧光。荧光猝灭通常可分为静态猝灭和动态猝灭。动态猝灭可以通过Stem．V01mer的公式(Eq1)来表示，而静态猝灭可以通过Lineweavef-Burkequation公式来描述(Eq2)％／F=1+bc9(Eq1)1慨一F)21佤+丘／(酬(Eq2)其中Fo和F表示无猝灭剂(聚集态化合物1)存在和有猝灭剂存在时，荧光基团的荧光；C。是猝灭剂的浓度，Ksv为动态猝灭常数，KLB为静态猝灭常数【61击51。如图3．2c，3．2d，3．3所示，通过增加聚集态的化合物1的浓度，荧光基团标记ssDNA的荧光强度的变化既符合Lineweaver-Burk公式呈现出良好的线性关系，又符合Stern．Volmer的公式呈现出良好的相关性，如图3．4。所以聚集态化合物1的猝灭机理既符合动态猝灭也符合静态猝灭【66‘671。然而，ssDNA是一个聚阴离子物质，它能通过静电作用引起带正电荷的化合物1的聚集。因此，化合物1的猝灭机理可以认为是聚集态的化合物1和DNA链的相互作用。在此种推理下，可以说DNA上标记的荧光团的荧光猝灭是分子间发生了强的疏水作用和n一Ⅱ堆 硕士学位论文积相互作用，具体见如图3．5。LLU薯1／【compound1】图3．3100nMP3关于Lineweaver-Burk公式的点。Fo和F分别表示加入化合物l前后荧光基团的荧光强度。激发波长：643nm，发射波长：670nm。【compound1】，pM图3．4100nMP1和P2关于Stern．V01mer公式的点。Fo和F分别表示加入化合物l前后荧光基团的荧光。350400●50500S50∞O6∞700WaVeIength，nm[=磊ii—一}1^瞳^M／＼L竺竺竺竺枷∞O咖WaveIength』nm图3．5加入DNA之后紫外可见光谱的改变。化合物l浓度为l“M，DNA浓度为100nM。实验中研究了TAMRA标记的探针DNA(P2链)在化合物1存在与不存在．27．咖嗽啪咐Ⅲ晰咖ouc暑-童t 皋于酶切放大的高灵敏新型核酸荧光探针的研究目标链T2时荧光强度的变化。如图3．6所示，加入1oonM的目标链T2时，可检测到4．5倍的荧光增强(在50mMTris．HCl，loomMNaCl的缓冲液中)。我们还研究了pH对化合物1在ssDNA和dsDNA上面聚集态的影响。如图3．7所示，pH值得变化对化合物1与ssDNA和dsDNA之间的结合力的差别是可以忽略不计的。由于聚集态化合物1对ssDNA和dsDNA不同的亲和力扩大了其在均相溶液中的荧光传感器的应用范围。WaVeIength，nm图3．6100nM的P2链在不同条件下的荧光图。(a)P2链+聚集态化合物与l；(b)P2+聚集态化合物1+100nMT2目标链。激发波长：559nm，发射波长：583nm。4e+52e+5dVAd5qAdsDNA。(lNA●ssDNAl●_j匍j||j||||||||||0||j||||||||||||0||||j|| 硕士学位论文浓度进行了优化。3．3．2．1j芭的衍生物浓度的优化【compound1】，nM图3．8不同的聚集态化合物l的浓度对传感器响应性能的影响。Fo和F分别表示加入50nM目标链前后传感器的荧光强度。激发波长：559nm，发射波长：583nm。图3．8为化合物1的浓度的变化对传感器信背比的影响。探针链和目标链的浓度分别为100nM和50nM。当化合物1的浓度低于1．4“M时，该传感器的响应信号随着化合物1浓度的增加而增加，但当化合物1的浓度大于1．4肛M时，传感器的响应信号随着化合物1浓度的增加而减小。造成这一结果的原因可能是由于高浓度的化合物1会阻碍ExoIII对双链的酶切作用，从而导致荧光增强较少，所以本实验中选用1．4pM的化合物1作为最佳实验浓度。3．3．2．2核酸外切酶III浓度的优化影响该传感系统性能的另一个重要因素是ExoIII的浓度。实验中，我们也对ExoIII浓度的影响进行了考察。如图3．9所示，传感器的信背比随着ExoIII浓度的增大而增加。当ExoIII的浓度为4U仙L时，达到了最大的信背比。继续增加ExoIII的浓度时，信背比反而下降。所以实验中我们选择ExoIII的浓度为4U／pL。 基于酶切放大的高灵敏新型核酸荧光探针的研究16141210ge642O01U列：阳4U。u叫IE)∞Ⅲ)u图3．9不同的ExoIII外切酶浓度对传感器响应性能的影晌。Fo和F分别表示加入50nM目标链前后传感器的荧光强度。激发波长：559nm，发射波长：583nm。3．3．3酶切信号放大我们通过对比存在与不存在ExoIII时的荧光效应来验证传感器的酶切信号放大功能。以TAMRA标记的探针DNA(P2)为例。当加入50nM目标链T2和4U的ExoIII后，在37℃下反应0．5h。加入目标链T2之后，ExoIII辅助的自催化作用导致荧光强度的急剧增加。如图3．10A所示，存在ExoIII时，当加入50nM目标链T2，传感器的信号只增加(210±12)％，相反的，在相同条件下，存在ExoIII时，若加入50nM目标链T2，传感器的信号增加了(1446±21)％。这个结果说明，该传感系统发生了目标DNA的信号放大。 硕士学位论文图3．10(A)传感系统在P2探针链的浓度为100nM，存在与不存在ExoIII时的荧光光谱图。(a)是存在ExoIII且T2目标链的浓度是50nM的荧光光谱图；(b)是存在ExoIII时空白样品的荧光光谱图；(c)是不存在ExoIII且T2目标链的浓度为50nM的荧光光谱图；(d)是不存在ExoIII时空白样品的荧光光谱图。(B)用后添加方法在加入不同浓度的DNA之后传感器的荧光光谱图。(C)荧光增强与目标DNA链的浓度之间的关系图。插图为传感器对低浓度目标DNA的校正曲线。Fo与F分别表示在加入目标链前后的传感器的荧光强度。3．3．4传感器的灵敏度我们探讨了两种方法(先添加和后添加方法)对检测目标DNA是否有影响。先将化合物1加入到TAMRA标记的DNA探针P2中，然后再加入目标链以及合适浓度的ExoIII，在37℃下反应0．5h。这种方法称为后添加方法。相反的，先添加方法是指首先将P2探针和目标链T2以及ExoIII在37℃下反应0．5h后，再．31．65咐渺时吣 基于酶切放大的高灵敏新型核酸荧光探针的研究j1《p竺竺。．“嚣＼～∥破帆三·赛詈·赉一1袋。■鼢HighfIuonlct眦tLOwnuOrescence图3．11基于聚集态化合物1作为广谱猝灭剂用先添加的方法用于放大多目标分析检测DNA的原理示意图。表3．2使用其他纳米材料进行DNA分析检测的性能 硕士学位论文5806006206406∞WaveIength，nm图3．12(a)用先添加方法在加入不同浓度的DNA之后传感器的荧光光谱图。(b)荧光增强与目标DNA链的浓度之间的关系图。插图为传感器对低浓度目标DNA的校正曲线。Fo与F分别表示在加入目标链前后的传感器的荧光强度。所有数据都是在激发波长为559nm，发射波长为583nm时记录的，并且所有数据都通过三次独立的实验记录所得。与之相反的，我们进行了没有ExoIII时各种DNA浓度检测的对照实验。检测下限只有2nM(见图3．13)。这个结果比有ExoIII参加的酶切放大的检测下限’差了2个数量级。这个结果表明引入ExoIII能显著地提高生物传感器的灵敏度。580600620640660WaVeIength，r帅图3．13(a)传感器中无ExoIII放大时，对不同浓度的目标DNA链的荧光光谱图。(b)荧光增强与目标DNA链的浓度之间的关系图。插图为传感器对低浓度目标DNA的校正曲线。Fo与F分别表示在加入目标链前后的传感器的荧光强度。所有数据都是在激发波长为559nm，发射波长为583nm时记录的，并且所有数据都通过三次独立的实验记录的。6融¨似鼢址协 基于酶切放大的高灵敏新型核酸荧光探针的研究j日芝毫t●Cl●0囡网圈国正网P1rr'P2P3堕网确网i网in网同图同P1P2P3，r3溪i网禽i圜网P1P2rr2P3，r3P1，r1阪，r2P3rr3图3．14多目标DNA检测的荧光响应图。FAM的检测条件：激发波长为494nm，发射波长为520nm；TAMRA的检测条件：激发波长为559nm，发射波长为583nm；cy5的检测条件：激发波长为645nm，发射波长为670nm。为了证明本文中所提出的广谱猝灭能力，进一步研究了该传感器在均相系统中用于多目标信号放大的多目标检测能力。实验中用到了三种探针，P1、P2、P3分别标记上FAM、TAMRA、Cy5。通过选择这三种荧光基团(三种荧光基团的激发波长分别为494nm、559nm、643nm，分别发射出蓝色(520nm)，橘色(583nm)和红色(670nm))来避免染料与染料之间的能量传递。将化合物1用于多种荧光基团和ExoIIII辅助的信号放大，可以有效地区分相似度很高的DNA序列并且同时对它们进行同时检测。存在相应的目标DNA时，荧光基团标记的ssDNA探针会与相应的目标DNA杂交形成双链DNA。当加入ExoIII时，会切割相应的荧光基团标记的DNA探针，相应的荧光基团(FAM、TAMRA或Cy5)的荧光强度将会增强。如图3．14a所示，当加入目标链T1时，FAM的荧光信号增强，而TAMRA与Cy5的荧光信号变化较小。同样的方法也可用于检测目标链T2或T3(见图3．14b)。实验也检测了两种DNA同时存在时的现象。当目标链T2和目标链T3都加入混合液中时，TAMRA和Cy5的荧光都增强(如图3．14c)。同时，FAM的荧光强度没有显著的变化。因此，我们的方法能用来分别同时检测目标链T1和T2、目标链T1和T3以及目标链T2和T3。此外，若三种目标链都存在时，可以检测到三种荧光基团的荧光都增强(见图3．14d)。实验还进一步评估了多目标分析平台分别对目标链T1和T2的灵敏度。图3．15表现了当存在不同浓度目标链T2或T3时，多目标传感系统的荧光强度的变化。从图中可以看出，荧光强度川I|￡m．|￡I￡l￡峭I￡¨仙伯”¨¨¨：暑¨65甜酬褂酬时o215O忙．，itg譬。_王g。蝗y-o拿．山 硕士学位论文随着目标链T2和T3浓度的增加而增加。图3．15b中可以看出在目标链Tl浓度在1oopM到10nM范围内呈现出动态变化，其检测下限为40pM。如图3．15d所示，目标链T2浓度在50pM到5nM范围内时，呈现良好的线性关系，检测下限为20pM。这些结果都能证明我们的多目标检测DNA的策略是可行的。芒2e+6o宝1e+6u．580600620640WaVelength，nm图3．15(a)多目标分析平台在不同浓度目标DNAT1链时的荧光光谱图。(b)荧光增强与目标链T1之间的关系。(c)多目标分析平台在不同浓度目标DNAT2链时的荧光光谱图。(d)荧光增强与目标链T2之间的关系。插图为传感器对低浓度目标DNA的校正曲线。Fo与F分别表示在加入目标链前后的传感器的荧光强度。3．3．5传感器的选择性在本实验中还考察了传感系统的选择性。我们比较了单碱基错配序列(T4)以及两个碱基错配序列(T5)的荧光响应并且与目标链T2作了对比，相关序列见表3．1。从图3．16可以看出，完全匹配的目标链T2能够使传感器的荧光增强13倍左右，而相同条件下的单碱基错配链(T4)的荧光强度只有4．6倍，同时，有两个错配碱基的DNA链(T5)荧光增强为2倍。从上述结果可得知，单碱基和两个碱基错配的DNA链荧光增强值比完全匹配的DNA链的荧光增强值低。由于目标序列中存在错配碱基，这可能会导致杂交反应的速度下降，同时还降低了双链DNA的稳定性。因此，该DNA传感系统具有良好的选择性。惦喁峭她拈孔∞．：．e，x=∞co_c一∞惦峭啃驰“孙缸k0，丁．∞～x=蚺c∞_c—moco∞m．．03一La 基于酶切放大的高灵敏新型核酸荧光探针的研究jd。；篡∞C旦三oCo协竺。主k图3．16传感器对目标DNAT2链(完全互补的目标链，75nM)与错配DNAT4链(一个碱基错配的链，75nM)和T5链(两个碱基错配的链，75nM)的荧光响应图。3．4小结阳离子聚集态的化合物1可以通过强静电相互作用作为一种免标记的广谱猝灭剂。它能有效地猝灭一系列标记在寡核苷酸上的从可见光到近红外光的荧光基团。本章通过将作为广谱猝灭剂的聚集态花衍生物与ExoIIII辅助的自催化目标循环放大相结合，提出了一个能用后添加方法、灵敏检测DNA的多目标分析平台。这种猝灭剂不会影响核酸酶的活性，所以无论是用先添加还是后添加方法，该传感系统都能得到较高的灵敏度。高猝灭效率与自催化目标循环的传感系统对目标DNA的检测具有高灵敏度。该传感系统对DNA的检测下限为20pM，比不使用酶切放大时的检测下限低50多倍。此外，该传感系统具有较好的特异性。通过提出的传感系统能在均相溶液中同时分析检测多目标DNA，证明了该传感系统在快速检测多目标生物分子方面具有潜在的应用价值。 硕士学位论文第4章DLISA：基于DNA酶的ELISA用于无蛋白酶4．1前言的免疫分析酶联免疫分析(ELISA)检测实际样品中的病原体是生物化学分析中一个重要的组成部分【68‘701。这种方法用一种酶(通常是辣根酶或磷酸酶)来催化基底转变成有色的或者高荧光量子产率的产物【71‘721。然而传统的ELISA通常使用蛋白酶作为生物催化剂来进行信号放大。在加热或者有重金属离子(如汞)存在等恶劣的条件时，会对蛋白酶造成不可逆转的破坏，这将大大减少ELISA的实际应用17引。固化的酶与溶液中的酶相比催化活性会大大降低。此外，ELISA分析主要测量浓度在超过10一12M范围内的蛋白【73—41。这个检测下限限制了它在需要检测到更低检测下限的领域的应用。在血清中很多重要疾病的标志物的浓度都是在10．16至10．12M之间【74。71。因此，发展一种方便的、稳定的、简单的、灵敏的并且低成本的新的无蛋白酶的免疫分析方法对疾病的诊断(尤其是早期阶段)是非常重要的。DNA酶是从组合的寡核苷酸文库中通过体外筛选分离出来的【79。81J。相比于蛋白质，核酸更稳定，适应性强并且它们可以使用市售的DNA合成仪合成。与蛋白酶相似，DNA酶显示出对特定底物的高催化性和水解切割活性，且DNA酶比蛋白酶更稳定，可以变性和复性的许多次，也不会失去其对基底的催化活性【25，31，821。因此，我们推测基于DNA酶的ELISA检测方法将会比目前的ELISA分析检测更可靠。这是由于基于DNA酶的ELISA检测方法不需要蛋白酶。我们组通过将DNA酶与分子信标结合设计了一种检测金属离子的分子信标催化(CAMB)的系统和高灵敏的小分子信号放大检测【27，831。这种独特的功能使得DNA酶更适合生物分析应用。将金属纳米粒子与金属离子触发的信号报告单元相结合是另外一种提高检测灵敏度的策略。许多前面报道的方法是利用强酸溶解来释放大量的金属离子来引起信号放大【84，85】。但是这种方法可能会由于传感系统的pH值的变化而引起信号的变动，导致结果的重现性差。此外，为了保持分析系统的pH平衡，还需要额外繁琐的处理步骤。最近，报道了一种快速、灵敏的基于阳离子交换(Cx)放大的方法可以释放出大量的二价阳离子【86’891。这个交换反应可以在室温下加入A矿之后的几分钟之内就能完成，不需要加入强酸或者强腐蚀性的氧化剂。这个基于 基于酶切放大的高灵敏新型核酸荧光探针的研究阳离子交换的荧光放大方法与基于有机荧光团的免疫分析相比呈现了更高的荧光信号增强【84，85】。因此，这种无蛋白酶的三步放大策略能大大提高其灵敏度。首先，由于纳米颗粒具有较大的比表面积，可以在表面接上大量的抗体，这样能增大分析的灵敏度。第二，每个纳米颗粒都能通过离子交换释放出大量的Zn2+到溶液中。第三，离子交换之后，一个DNA酶可以催化多个基底。因此，CAMB系统能通过基于Zn2+辅助的DNA酶的循环和再生来实现多次信号转变。在本章中，提出了一种用DNA酶代替蛋白酶来用于ELISA检测的方法，称其为DLISA。这种三重放大的DLISA平台包括了上文中描述的CAMB系统和阳离子交换信号放大，由于无蛋白酶的设计使其更稳定，并且表现出了多目标超灵敏荧光信号，所以其可以代替传统的ELISA分析。实验中使用了人IgG作为抗原模型来验证所提出的概念。该三重放大的DLISA免疫分析方法展现了对人IgG检测的超高灵敏度，检测下限为2龟加L(3×10。1‘7M)。这比传统的ELISA的检测下限低得多，也比之前报道的其他免疫分析方法的检测下限低【84·90‘95】。这种三重放大的DLISA平台被应用于构建一个能同时检测三种目标物(人IgG，兔IgG和鼠IgG)的阵列，得到了令人满意的结果，也证明了该平台可用于多目标分析的能力。4．2实验部分4．2．1试剂与仪器实验所用核酸链均由宝生物工程有限公司(大连，中国)合成，其序列如表4．1所示。人IgG、小鼠IgG、兔IgG、生物素标记的羊抗人IgG、生物素标记的羊抗小鼠IgG、生物素标记的羊抗兔IgG和牛血清蛋白(BSA)购买于鼎国生化试剂公司(北京，中国)。其他的试剂购买于Sigma公司(美国)。其他所用试剂均为分析纯，无需进一步纯化。实验中所用的水为超纯水，电阻系数大于18．2MQ·Cm。表4．】本实验中所用到的核酸序列核酸序列(5’一3’)MB—probeFAM-CCACCACAATGTTATACAGGTACTATrAGGAAGTTGAGTTACGAGGCGGTGGTGG·BHQ1DNAzymeCTCAACTTCTCCGAGCCGGTCGAAATAGTACCT本实验所用的荧光检测仪器为Synergy2型多功能酶标仪(基因公司，美国)。激发波长为480nm。除非特别说明，所有检测均在室温下进行。 硕士学位论文4．2．2衍生颗粒ZnS纳米颗粒(ZnSNCs)与抗体结合是参考的文献【68硼】。通过EDC和磺基．NHS的作用，将链霉亲和素有效地耦联到氨基化的ZnSNCs表面上。取70“L的原ZnSNCs用超纯水离心三次之后，再用O．005％Tween．20的溶液离心并且分离。将25肛L的链霉亲和素与6mgEDC和5mg磺基．NHS混合，以此来活化链霉亲和素表面的羧基。活化15min之后，加入1pL的2．巯基乙醇，将未反应完的EDC猝灭，以阻止蛋白之间的交联。将ZnSNCs加入到活化了的链霉亲和素溶液中，将混合溶液在室温下振荡3h。最后，将链霉亲和素．ZnSNCs用r=6000的转速离心分离，并且重新分散在100斗L的1×PBS中。将15肛L的生物素．羊抗人IgG加入到链霉亲和素．ZnSNCs中，并且在室温下孵育1h，制得该免疫分析实验中需要的羊抗人IgG．生物素．链霉亲和素．ZnSNCs复合物。在多目标检测的实验中，将链霉亲和素-ZnSNCs悬浮液与10此1．5mg／mL的生物素-羊抗人IgG、lO肛L1．5mg／mL的生物素．羊抗兔IgG、10pL1．5mg／mL的生物素一羊抗小鼠IgG在室温下孵育1h。将最后所得产物用1×PBS清洗，在分析实验之前，用5％BS～PBS的溶液封闭。4．2．3免疫分析三明治夹心结构的免疫分析是在96微孔板中进行的。首先，微孔板被100pL20p∥mL的抗体在4oC下包被过夜，然后用150pL5％BSA溶液(用PBS配制的)在室温下封闭30min，接着用l×PBS清洗三次。在微孔板中加入100pL目标物，并且在4oC下孵育过夜。将微孔板用1×PBS清洗三次之后，加入100此羊抗人IgG．生物素．链霉亲和素．ZnSNCs复合物，在室温下孵育4h。加入14pLlmMAgN03进行离子交换，10min之后加入150nMMB和75nM8．17DNA酶，在37℃下反应60min。ELISA使用相同的方法。不同之处为加入生物素．羊抗人IgG在室温下孵育3h之后加入100斗L0．35pg／mL的生物素．HRPPBS溶液，并且在室温下孵育1h。4．3结果与讨论4．3．1原理设计这个新型的三重荧光放大的DLISA免疫分析系统的设计原理如图4．1所示。它由三个关键部分组成：抗体修饰的96微孔板，znSNCs标记的抗体和CAMB系统；由于znSNCs具有较大的比表面积，能够在其表面共轭大量的抗体来增大检测的灵敏度，所以实验中将ZnSNCs作为标记物。此外，ZnSNCs具有较好的生物兼容性，封闭的阳离子(zn2+)通过A矿诱导阳离子交换这种简单、无腐蚀 基于酶切放大的高灵敏新型核酸荧光探针的研究性的方法就能很快被释放出来。优化了Ag+的浓度之后，不需要使用微波辐射来辅助阳离子交换。由于8—17DNA酶具有高度催化活性而被选作CAMB系统的催化因素。通过选择Zn2+作为辅助因子来扩展其功能。如图4．1所示，当有目标抗原时，连接了ZnSNCs的抗体能够被捕获在抗体修饰的96微孔板上，从而形成三明治的夹心复合结构。随后加入A矿，通过阳离子交换从znsNcs中释放出Zn2+。每个纳米颗粒通过离子交换能释放出成千上万个Zn2+到溶液中。因为DNA酶能催化切割多条底物链，CAMB系统通过Zn2+辅助的DNA酶循环和再组合来提供信号放大从而实现多种酶检测的信号转变。本实验提供了对目标抗原的无蛋白酶、三重放大检测，同时比传统的ELISA或者其他只有一步信号放大的免疫分析系统具有更高的灵敏度。≤喜誊谢伫耋篷≥一煮嘴黼h西。Hm∞IlG●R|bb“kG—M●u∞I■GGoa}aI嚏ihI眦a“I‘G蛔叠gtGo。}训nbhh=等IlGGol“}antimous2I富GY·o薛-曲ntanIlGYI。非锄6r“b矗IIGE。靠柚由t-us-kG图4．1无酶、三重放大的DLISA策略用于多目标检测的原理示意图。4．3．2颗粒表征具有半中空核．壳结构的ZnSNCs是根据文献【89】中来合成的，并且通过透射电子显微镜(TEM)来表征。合成得到的ZnSNCs呈球形，均匀地分散在溶液中(见图4。2a)。此外，ZnSNCs中有多孑L结构，由疏松的小晶形体堆积而成，使其能快速地进行离子交换。这些都可以通过TEM(见图4．3)和荧光光谱(见图4．2b)来证明。从图4．4中可以看出，znSNCs与抗体耦合后，倾向于聚集在一起，这表明ZnS—Ab2复合物已经成功合成。znS．Ab2的耦合还通过动态光散射(DLS)来进一步表征(图4．2c，图4．5)。为了证明这种新型的无蛋白酶、三重放大的DLISA传感平台的可行性，选择了用人IgG作为分析物。在相同的条件下进行了对比实验，实验结果如图4．2d所示。当没有A矿存在时，zn2+不能从znsNCs中释放出来，8—17DNA酶在没有Zn2+作为辅助因子时，不能催化切割分子信，游．J+啦芰o-§ 硕士学位沦文标底物链。因此，只能检测到很低的荧光信号。在另外一组对照实验中，没有羊抗人IgG，也只能检测到较低的荧光强度。当加入高浓度的EDTA到置换出zn2+的溶液中时，由于Zn2+会被EDTA螯合，也只能检测到很低的荧光信号。如预期的结果，当人IgG和Ag+都存在时，可以检测到较强的荧光信号。从而证明了该无酶、三重信号放大的DLISA策略是可行的。～誊崎Gno●哺JqGno^口+∞T^bu№7图4．2(a)znsNCs的TEM图像。(b)不同条件下传感系统的荧光响应图。zn2+浓度为150“M，Ag+浓度为140肛M，MB的浓度为150nM，DNA酶的浓度为75nM。(c)ZnSNCs的水动力尺寸大小。(d)传感系统在不同条件的荧光响应图。人IgG的浓度为1ng／mL，EDTA的浓度为50mM。图4．3通过阳离子交换形成A92S的TEM图。O舶O翻O5O52，‘1．：．曙，_一i墨￡●l一26jZ 基于酶切放大的高灵敏新型核酸荧光探针的研究图4．4共轭接上抗体之后的ZnSNCs的TEM图像。图4．5DLS测出的纳米粒子的水动力尺寸分布图：(a)ZnSNCs；(b)znS．Ab2复合物。4．3．3Ar浓度的优化为了获得最佳的传感性能，实验优化了Ag+的浓度。实验结果表明，当Ar浓度小于140pM时，荧光信号随着Ag+浓度的增大而增强。如图4．6所示，当A矿浓度为140pM时，能使传感系统达到最大信背比。因此，140肛M的A矿浓度被选作进一步实验的最佳条件。之前已经报道过的基于ZnSNCs阳离子交换信号放大，封闭的Zn2+需要通过2min的微波辅助进行阳离子交换来释放【891。但是，在本实验中，当Ar浓度增加时，多孔的结构和许多小晶体堆积而成的znsNcs能够快速地进行阳离子交换不需要微波辅助就能够在10min内得到较高的Zn2+浓度。 硕士学位论文∞801∞1201401∞Ag+conc帅tr砒ion(1棚)图4．6加入不同浓度Ag+时传感系统的荧光响应图。F和Fo分别表示存在与不存在人IgG时的荧光强度。人IgG的浓度为lp∥mL。4．3．4传感器的灵敏度这种无酶、三重放大的DLISA策略具有高灵敏度，对人IgG具有较好的选择性。如图4．7a所示，当加入不同浓度的人IgG时，荧光强度随人IgG浓度的增大而增大。目标蛋白浓度与荧光强度之间存在线性关系(图4．7b)。得到的检测下限为2麾／mL(3×10‘117M)，这相当于能在loopL的样品中检测到1800个IgG分子。该检测下限比之前报道的比色法【84，90。91】、荧光法【87’92‘931和电化学方法【94‘95】要低。为了更好的评估我们提出方法的优越性，实验中将无酶、三重放大的DLISA方法与传统的ELISA方法做了比较。ELISA是分析检测中一种普遍的、有效地检测方法，它通过用HRP酶标记的免疫试剂来产生信号。羊抗人IgG接在HRP酶。最后通过HRP酶标记的抗体检测出人IgG的浓度为10ng／IIlL，计算得到的检测下限为5ng／mL(见图4．7d)。然而实验中所采用的方法对人IgG的检测比HRP酶的方法要灵敏得多。相比于蛋白，核酸更稳定、更实用，并且能够通过商业化的DNA合成仪合成得到。此外，由于在传统的ELISA中HRP酶不稳定，它容易变性并且失去活性。再者，过氧化氢(H202)也不稳定导致其在长时间的储存过程中会失去氧化能力【781。在本章所提出的方法中，检测目标物不需要修饰蛋白酶，稳定性得到大大的改善。 基于酶切放大的高灵敏新型核酸荧光探针的研究HRP·antjbOdy人．℃业丫S暑jh帅矾IgGig∞t硼tihum狮IgG《图4．7(a)传感系统识别目标人IgG的荧光图像。(b)荧光强度与目标物浓度的关系图。(c)低浓度的目标物的对数与荧光强度的关系图。(d)用常用的ELISA方法测的不同浓度的人IgG(O，10ng／mL，100ng／mL，1“g／mL，10肛g／mL)与紫外吸收值之间的关系图。4．3．5传感器的选择性在分析系统中选择性是另外一个关键的因素。在与检测人IgG相同的实验条件下，考察了该传感系统对几种非目标蛋白(溶菌酶，链霉亲和素，牛血清蛋白)的荧光响应情况。如图4．8a所示，只有人IgG引起了较大的荧光增强，其他的蛋白几乎没有荧光强度的变化。为了检验该荧光传感系统的实际应用能力，我们还做了竞争实验。将1ng／mL羊抗人IgG，10ng／mL羊抗兔IgG和10ng／mL羊抗鼠IgG混合均匀加入10mMPBS中(pH=7．4)。实验结果表明，其他的蛋白不会干扰人IgG的检测(如图4．8b)。这更进一步说明了该传感系统对人IgG的检测具有很好的选择性。这一系列的实验都表明了我们提出的这种传感系统能符合生物医学应用中选择性的要求。 硕士学位论文bumrlys。zyIIl·sABsAhumInI口G‘u’hum训gG2m⋯gG船扪’gGbu晰吡mnI∞^m-nl口。一^1∽I^q泓’Bbu储图4．8(a)传感系统对人IgG的选择性考察，其中人IgG浓度为lng／mL，其他干扰物的浓度为lng／mL。(b)传感系统对人IgG的选择性考察，其中人IgG浓度为1ng／mL，竞争蛋白(兔IgG和小鼠IgG)的浓度为10ng／mL。4．3．6传感器用于多目标检测最近的研究表明，通过测量多种标志物，几乎能100％的成功预测某种特定的癌症【100’1021。因此，为了进一步验证无蛋白酶的、三重放大的DLISA策略能用于多目标免疫分析，实验还对多蛋白阵列进行了定点检测。首先，在ZnSNCs表面均匀地共轭上羊抗人IgG，羊抗兔IgG和羊抗小鼠IgG固定在96微孔板上，然后把含有人IgG，兔IgG和小鼠IgG的混合蛋白加入到微孔板中。将接了抗体的ZnSNCs加入到微孔板中进行分析。当反应完全之后，用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗96微孔板，将没有结合上的znSNCs清洗掉。在多目标分析中，由于抗体的非特异性吸附，容易导致背景高、灵敏度低等问题。因为交联反应会降低蛋白的特异性、灵敏度和量化度，所以为了避免抗体和其他蛋白之间的交联反应，高特异性的抗体和合适的检测方法是很重要的。从这个实验结果看到，只有固定了相关抗原的区域才有比较强的荧光信号。这又进一步证明了该检测系统的特异性(见图4．9)。从得到的荧光强度也可以证明，连接了特异性抗体的ZnSNCs之与固定在基地上的相应的抗原呈阳性反应，而对其他的两种抗原成阴性反应。这项研究表明这种无酶、三重放大的DLISA方法在多目标分析中有潜在应用价值。654321O绀。兰。畔岜 基于酶切放大的高灵敏新型核酸荧光探针的研究ln}H2掣R!竺“唑鉴。buf|吖《bJH。。Rabbn帆。。M。，¨¨蛔GIgG‘¨，f裂”“。：翟⋯‘’裂”bun‘Go越·．an帅‘期’ant-·畸G需‰。．+．amr曲bn-t·I口G舞‰∞．+．捌呲I“删∞-oToIgC60时．0n卅1umanlgG60嗣．1narjb断tI口GGO乱硼6mous●l口Ghum扣畸G憎岫hI口Omou¨崎Gbu什Hhum-nIgG曙¨h-gGmou¨畸Gbuhr～m-nI口cr-砧nIacmou¨1口cbut|·图4．9(a)多目标检测三种目标物(人IgG，兔IgG，小鼠IgG)的预期荧光响应图像。(b)多目标检测三种目标物(人IgG，兔IgG，小鼠IgG)的实际荧光响应图像。(c)多目标检测三种目标物(人IgG，兔IgG，小鼠IgG)的荧光强度柱状图(左：第一行：中：第二行；右：第三行)。所有目标物的浓度均为lng／mL。样品的高通量检测在免疫传感器和多目标分析测试(尤其是在疾病的早期筛查)的发展中都是一个长远的目标。在测试了无酶的、三重放大DLISA方法在多目标分析中的可行性之后，进一步研究了以高通量的方式在96微孔板中对目标物进行平行分析的能力。在目标蛋白存在时，根据图4．1O中的荧光图像可知，ZnSNCs共轭的抗体已经成功杂交在相应的目标物出现的点。由这个结果表明，我们的方法能够以高通量的方式用于平行免疫分析。因此，我们开发的多目标免疫分析能完全满足临床应用的需求。 硕士学位论文laJ‰‰‰呐．-G坼Hmm哪嗽暇I口CP■SR■哺*P髓P‘SIgcM■nR柚■P_■嗽I口CP日$R●bb曩MOuseP鹋崎cIgcH_嘲R■悄M啊J靶嘲啪呐Igc【．．．．．．。．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．一～m·n崎O一■●n190吊w¨崎口but_“l～_柙●一悖■抽I口o_州"崎o々‘-．．■hum·n畸G嗜bbR崎G_ou”●●Obuhr～_-n●●O曙bM‘口G惴··●gOb。_-ho_"．-on鼬I．o_M·I-o¨-图4．10(a)高通量检测目标物的示意图。(b)高通量检测的预期结果。(c)高通量检测的实际荧光图像。(d)高通量检测各种目标物的荧光强度柱状图。所有目标物的浓度为10ng／mL。4．3．7传感器用于实际样品的检测为了评估设计的传感器在实际样品中的分析应用能力，我们考察了在细胞裂解液(一种含有多种蛋白质和其他生物分子的真实复杂介质)中加入不同浓度人IgG的回收率情况。分析结果如表4．2所示，我们可以观察到在真实的细胞样品中得到了较好的回收率，这说明该传感系统能够用于人IgG的实际样品的检测。为了证明我们的方法在实际样品中对多目标免疫分析的检测潜力，在细胞裂解液中进行了目标物的检测。将人IgG和兔IgG混合加入20％的细胞裂解液中。如图4．11所示，共轭了抗体的znSNCs对相应的目标有响应。这个结果表明了无酶、三重放大DLISA方法可以用于实际样品的检测。表4．2在细胞裂解液样品中人IgG的回收率实验。[a]三次测量结果的平均值。【b]三次测量结果的标准偏差。．+．+．+ 基于酶切放大的高灵敏新型核酸荧光探针的研究Got卜an晴●啪狮IgCGo砒·扪tjrabbnIgCHumanRabbnbuffe‘II，lgGIgG+．+豳图4．11(a)在细胞裂解液中多目标检测两种目标物的预期荧光响应图像。(b)在细胞裂解液中多目标检测两种目标物的实际荧光响应图像。(c)在细胞裂解液中多目标检测各目标物的荧光强度柱状图。所有目标物的浓度均为lng／mL。4．4小结在本章中，我们报道了一种用DNA酶来进行ELISA检测的DLISA方法。通过将CAMB系统与基于阳离子交换的纳米颗粒放大免疫分析相结合，我们构建了一种新型的、无酶的、三重放大DLISA平台。该平台具有高灵敏度，较好的选择性，并且能对目标抗原进行多目标荧光检测。由于没有采用蛋白酶进行检测，大大提高了检测系统的稳定性。此外，这种方法能通过高通量方法进行多目标检测。该方法操作简单，成本低。本章中，这被用来检测人IgG、兔IgG和小鼠IgG的荧光生物传感系统由于其具有三重信号放大策略，其检测的灵敏度得到了显著的提高。这个方法对IgG的检测下限为2绝／ml(3×10。17M)，比传统的ELISA以及之前报道的免疫分析方法的检测下限都要低。这种高通量的、稳定的、精确的多目标荧光免疫分析方法在临床诊断中显示了其潜在的应用价值。哪鲫枷澌啪伽枷o 硕士学位论文结论综合相关文献报道，针对当前生物传感器的构建以及目前核酸、蛋白质等的检测中存在的一些焦点问题，重点关注如何提高传感器的灵敏度，本文利用花的衍生物高的猝灭效率以及核酸外切酶和DNA酶的信号放大技术设计了几种灵敏度高、选择性好、操作简便的新型生物传感器用于检测DNA、蛋白等重要生物分子。主要研究成果如下：(1)基于聚集态茈的衍生物的高猝灭效率，参考已经发表的文献，分别提出了一种多目标检测核酸内切酶(第二章)和DNA(第三章)的高灵敏、高选择性的荧光增强型生物传感器。在第二章中，我们首次提出了聚集态的花的衍生物可作为广谱猝灭剂猝灭一系列标记在DNA上的荧光基团的荧光。以核酸内切酶EcoRI和Ec01w作为模型目标物，在最佳的实验条件下，测得EcoRI和EcoRV的检测限分别为O．05U／mL和O．03U／mL。此外，该传感器利用聚集态的茈的衍生物作为猝灭基团，使得该传感器具有成本低、灵敏度高、设计简单、操作简单且不需要双标记等优点。在第三章中，基于聚集态的茈的衍生物具有较高的猝灭效率和ExoIII的信号放大技术构建了一种荧光生物传感器用于多目标DNA的分析检测。实验中使用聚集态的茈的衍生物作为荧光猝灭剂，不仅可以获得较低的荧光背景值且可以降低实验成本。此外，当目标DNA链与探针链杂交之后，ExoIII可以切割探针链，释放出目标DNA从而与其他的探针链杂交，诱发下一轮循环，实现信号的循环放大。由于花的衍生物具有较好的生物兼容性，使得该传感器既能采用先添加的方式，又能采用后添加的方式进行实时检测。正因为这些优点，该传感器可以实现同时多目标DNA检测，检测下限为20pM，比不使用酶切放大时的检测下限低50多倍。因此该传感系统在快速检测多目标生物分子方面具有潜在的应用价值。(2)在第四章，我们基于DNA酶的信号放大技术和ELISA策略构建了一种新型荧光生物传感器用于IgG等抗原的多目标检测。在传感器的构建中，我们采用了三明治夹心结构的ELISA，同时，利用了阳离子交换反应，将目标物进行放大，最后，我们引入了具有信号放大作用的DNA酶，使得荧光信号得到多步放大，因此，所构建的传感器具有较高的灵敏度。我们以人IgG为模型目标物，在最佳的实验条件下，测得其检测下限为2龟／mL，低于已报道的文献。该传感器还显示了较好的选择性，能较好的区分与类似目标物的分子。此外，利用DNA酶代替了蛋白酶进行检测，大大提高了检测系统的稳定性。实验中还利用人IgG、兔IgG、小鼠IgG为模型目标物，实现对抗原的多目标检测。因此，基于DNA酶 基于酶切放大的高灵敏新型核酸荧光探针的研究与ELISA的DLIsA的传感平台有望用于免疫分析和临床医学分析领域。．50． 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