DB34∕T 2850-2017 番鸭细小病毒ＰＣＲ检测方法.pdf

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1、ICS11.220B41DB34安徽省地方标准DB34/T2850—2017番鸭细小病毒PCR检测方法DetectionMethodofMuscovyDuckParvovirusbyPCR文稿版次选择2017-03-30发布2017-04-30实施安徽省质量技术监督局发布DB34/T2850—2017前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由安徽省农业科学院畜牧兽医研究所提出。本标准由安徽省农业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：安徽省农业科学院畜牧兽医研究所、安庆永强农业科技股份有限公司。本标准起草人：戴银、潘孝成、胡晓苗、张丹俊、黄永强、赵瑞宏

2、、周学利、侯宏艳、沈学怀、胡业和、夏生林、吴娟、王骏俊、朱传民。IDB34/T2850—2017番鸭细小病毒PCR检测方法1范围本标准规定了番鸭细小病毒的PCR检测方法。本标准适用于番鸭肝脏、脾脏、胰腺病变组织、番鸭胚尿囊液中番鸭细小病毒核酸的检测。2术语和定义下列术语和定义适用于本文件。2.1番鸭细小病毒MuscovyDuckParvovirus，MDPV属于细小病毒科、细小病毒亚科、依赖病毒属，基因组为线性、单链DNA。3检测方法3.1仪器3.1.1PCR仪扩增仪。3.1.2台式低温高速离心机，温控范围：-4℃～25℃。3.1.3电泳仪，电压范围：60-120V。3

3、.1.4凝胶成像系统。3.1.5冰箱。3.1.6微波炉。3.1.7水浴锅，温控范围：37℃～100℃。3.1.8微量移液器，可调量程：0.5～10ul，10～100ul，100～1000ul。3.2试剂和材料3.2.1细胞裂解液，见附录A中的A.1。3.2.2酚、氯仿、异戊醇、异丙醇、乙醇。3.2.3蛋白酶K。3.2.4灭菌双蒸水。3.2.5TaqDNA聚合酶。3.2.6dNTP。3.2.7DNA分子量标准：DL2000DNAMarker。3.2.8溴化乙锭（EB，10µg/µL）或核酸染料。3.2.9磷酸盐缓冲液（PBS，0.01mol/L，pH7.2），见附录A中的

4、A.2。3.2.1050×TAE电泳缓冲液，见附录A中的A.3。1DB34/T2850—20173.2.111％琼脂糖凝胶，见附录A中的A.4。3.2.121×TE缓冲溶液，见附录A中的A.5。3.2.13根据番鸭细小病毒的基因组序列保守区，设计1对特异性引物：上游引物5’-GCTCTTTGCTTCAGTTGCTC-3’，下游引物5’-ACTTGCTTCTCCTCCACTAT-3’。扩增基因片段长度为861bp。3.2.14阳性对照样品：MDPV接种的番鸭胚尿囊液；阴性对照样品：未接种的正常番鸭胚尿囊液。3.3操作步骤3.3.1样品的采集及处理a)采样工具——15mL离

5、心管、1.5mL离心管、剪刀、镊子和研钵，经121（±2）℃，15min高压灭菌并烘干。b)病料的采集与处理——无菌采集病死或剖杀的番鸭肝脏、脾脏、胰腺病变组织剪碎，按1:5倍体积加入PBS，研磨，装入15mL灭菌离心管中，5000rpm离心10min，取上清液转入1.5mL离心管中，-20℃保存备用。c)MDPV接种的番鸭胚尿囊液——将尿囊液经5000rpm/min离心10min，取上清转入1.5mL离心管中，-20℃保存备用。3.3.2DNA的提取a)阳性对照、阴性对照和待检样品同时提取DNA。取200μL样品和800μL细胞裂解液置于一个1.5mL离心管中，加蛋白

6、酶K10μL（2mg/ml），颠倒混匀。b)在65℃恒温水浴锅中水浴30min，或在37℃恒温箱中1h，间歇振荡数次。12000rpm离心5min，取上清入另一EP管中。c)加入等体积酚、氯仿、异戊醇（25:24:1），室温振荡5min，12000rpm离心5min，取上清入另一EP管中。可以抽提两次。d)加等体积的异丙醇，轻摇5min，室温放置5min，12000rpm离心5min，弃上清。e)加入800μL70％乙醇，12000rpm离心5min，弃上清，干燥15～20分钟，加入20～30μLTE，-20℃保存或直接PCR。3.3.3PCRa)PCR反应体系——10

7、×PCRBuffer2.5μL，dNTPs（2.5mmol/L）2.0μL，上游引物和下游引物（20pmol/µL）各1.0μL，DNA1μL，TaqDNA聚合酶0.25μL，加双蒸水补足25μL。b)PCR反应条件——94℃预变性5min后；94℃1min，47℃1.5min，72℃2min，33个循环；最后72℃延伸10min。3.4电泳将PCR扩增产物5μL与2μL上样缓冲液混合，点样于1％琼脂糖凝胶板加样孔中，琼脂糖凝胶板一侧点样孔加入DL2000DNAMarker，缓冲液为1×TAE，以5V/cm电压电泳30min左右。3.5结