免疫荧光染色观察肿瘤细胞骨架.ppt

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1、免疫荧光染色观察肿瘤细胞骨架实验九实验目的与要求掌握免疫荧光技术的基本原理;了解免疫荧光技术在生命科学中的广泛应用.一、实验的基本原理荧光显微镜是一种较为常用的的光学显微镜，其基本原理是利用一定波长的激发光对样品进行激发，使之产生一定波长的荧光，从而用于对样品结构或其组分进行定性、定位、定量观察检测。抗体能特异性地识别相应的抗原，并与之结合。这种结合在体外也能发生，这种特性就是许多免疫检测方法的基础。荧光技术与免疫技术的结合可用于对样品结构或其组分进行定性、定位、定量观察检测。三、试剂与器材人肿瘤细胞涂片甲醇、H2O2、滤纸、PBS、正常羊血清封闭液、一抗、FITC标记的IgG、甘油/P

2、BS封片剂、盖玻片荧光显微镜玻片细胞置于甲醇中-10℃固定5min，室温凉干（或冷丙酮固定5min，室温凉干）；PBS漂洗2min×3次；3%H2O2室温孵育10min（以去除细胞内源性过氧化物酶活性）；PBS漂洗5min×3次；10%正常羊血清封闭液（0.1MPBS配制）室温封闭20min；弃封闭液（此步骤不必PBS洗涤）；四、实验步骤用适当比例稀释的一抗（一般稀释比为1:100-1:200）37℃孵育1h（或4℃孵育过夜）；PBS漂洗5min×3次；用适当比例稀释的二抗（FITC标记的IgG）（一般稀释比为1:100-1:200，用加有BSA的TBS－T配制）室温孵育30min（

3、避光黑暗条件下进行）；PBS漂洗5min×3次；甘油/PBS封片剂（PBS:甘油=1：9，v/v，pH8.0-8.5）封片；荧光显微镜或激光共聚焦扫描显微镜观察拍照。五、注意事项1.注意各级抗体浓度的使用范围;2.荧光抗体孵育时要注意避光;3.注意各步骤的漂洗要充分.六、作业与思考题试述免疫荧光技术的基本原理,并描述实验中所观察的实验现象.思考题:试比较免疫荧光技术与免疫细胞化学技术的异同.