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时间：2019-01-25
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1、 利用免疫荧光染色观察转入YFP-PKCθ的E6.1细胞在CD3/CD28抗体刺激下活化的影响许耀豪（中山大学生命科学大学院，广东广州510275）摘要：T细胞在接受CD/3CD28共刺激信号的作用下，表面蛋白会聚集成帽状结构。本实验通过免疫荧光染色法，观察转入PKCθ的
2、T细胞在及是否接受CD3/CD28信号刺激等不同条件下，在IgG辅助时活化的影响。结果显示转入PKCθ的细胞会形成明显的帽状结构，而空白对照组没有，显示PKCθ对T细胞活化的促进作用。关键词：PKCθ；CD3/CD28；T细胞在T细胞中,PKCθ是诱导AP-1活化的信号途径中的重要因子。而同时，c-Jun蛋白N-末端激酶(JNK)的活性可以激活AP-1。PKCθ能够在T细胞特异性的活动中活化JNK,而PKC的其他亚型则没有这个功能。T细胞的TCR和CD28信号途径都需要JNK的活性[1-2]。TCR四种亚基的胞质部分均
3、很短,不具有传递抗原刺激信号的能力,但可通过与CD3分子形成TCR/CD3复合物,传递细胞刺激信号。由于TCR与IgG结合后，膜上的TCR/CD3与CD28、LFA-1等各种跨膜辅助受体很快聚集并形成集中有序的富含鞘磷脂和胆固醇的脂筏(raft)微区，故在显微镜下为可见荧光的弧线状的capping结构[3]。CD3/CD28刺激T细胞的原理，是在CD3抗体刺激T细胞后，使细胞发生钙离子浓度升高，磷脂分解等。然后CD28提供第二信号的刺激，使得TCR/CD3复合物能实现上述信号传递过程，形成capping[4]。因此，用
4、YFP标记的PKCθ在CD3/CD28抗体刺激后，加入的IgG可将CD3和CD28形成一个集群聚集在膜上，刺激后可以使得PKCθ上膜与之聚集。所以，一系列的级联反应的后果就是，转染了YFP-PKC的细胞，其表达的YFP-PKC蛋白在CD3/CD28刺激的情况下被激活而上膜，与CD3/CD28聚在一起，所以在膜上形成了YFP荧光的capping结构。1主要材料方法1.1材料质粒提取试剂（Magen公司）电转：Lonza 4D Nucleofector 细胞核转染仪显微镜观察：Zeiss倒置荧光显微镜（Zeiss公司）Ju
5、rkatE6.1细胞：悬浮的T细胞系YFP-PKCθ和YFP-C1质粒含10%FBS的RPMI-1640培养基免疫组化笔IgGCD3/CD28抗体1.2方法质粒提取：利用Magen公司的HiPurePlasmidEFMicroKit方案进行无内毒素质粒提取。电转：取含有3×106个细胞的培养液，在200g条件下离心5min；进行Hank’s洗涤后，再于200g条件下离心5min；电转Buffer重悬细胞。将细胞与提取好的3μg/杯的YFP-PKCθ和YFP-C1质粒混合后，在Lonza 4D Nucleofector
6、细胞核转染仪进行电转。电转后，讲细胞转移至预先预热至37℃的35mmdish，3mL/dish的含10%FBS的ROMI-1640培养基中。E6.1细胞培养：在37℃5%CO2下培养细胞约48小时PLL包被的载玻片准备：用免疫组化笔在干净的玻片上画两个圈，晾干5min后，每个圈内加入50μLPLL，室温孵育15min，真空泵吸除，37℃烘箱烘干。收细胞：取5×105细胞，200g离心5min，去上清后用100μL无FBS的RPMI-1640重悬，冰上静置15min。刺激细胞：加入终浓度为10μg/mL的CD3抗体和终浓
7、度为2μg/mL的CD28抗体，冰上孵育10min后，加入10μg/mL的IgG进行交联。迅速放置于thermomixer37℃8000rpm/min离心5min。铺细胞：4℃8000rpm/min离心30s终止刺激，去上清后用100μL含10%FBS的RPMI-1640重悬细胞，并置于孔中，室温静置20min。固定细胞：4%PFA固定细胞15min。渗透：0.2%Triton-X100渗透10min。封闭：2%BSA封闭30min染细胞核：用DAPI进行5min细胞核染色封片：经PBS洗涤后封片。显微观察：在显微镜下
8、依次观察未刺激的转入YFP-C1的细胞、已用CD3/CD28抗体刺激的转入YFP-C1的细胞、未刺激的转入YFP-PKCθ的细胞和已用CD3/CD28抗体刺激的转入YFP-PKCθ的细胞。2结果图1：C1PKC（细胞核与PKCθ荧光）（PKCθ荧光）（细胞核与PKCθ荧光）（PKCθ荧光）（-）（+）（细胞核与PKCθ荧光）（PK
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