DB22T 2559-2016 牛新孢子虫病检测方法LAMP法.pdf

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1、ICS11.220B41备案号：54236-2017DB22吉本标准仅供内部使用不得翻印林省地方标准DB22/T2559—2016牛新孢子虫病检测方法LAMP法LAMPassayfordetectionofbovineNeosporaosis本标准仅供内部使用不得翻印2016-12-09发布2017-03-01实施吉林省质量技术监督局发布本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T2559—2016本标准仅供内部使用不得翻印前言本标准按照GB/T1.1-2009和GB/T20001.4-2015给出的规则起草。本标准由吉林省畜牧业管理局提出并归口。本

2、标准起草单位：延边大学、吉林省动物疫病预防控制中心。本标准主要起草人：贾立军、柴方红、张守发、梁晚枫。本标准仅供内部使用不得翻印I本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T2559—2016本标准仅供内部使用不得翻印牛新孢子虫病检测方法LAMP法1范围本标准规定了牛新孢子虫病LAMP检测方法的技术要求。本标准适用于牛新孢子虫病病原检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方

3、法3术语和定义下列术语和定义适用于本文件3.1本标准仅供内部使用不得翻印新孢子虫病Neosporiasis由犬新孢子虫(Neosporacaninum)引起的多种动物的一种原虫病，该病主要引起母畜的流产、死胎或新生胎儿的运动障碍和神经系统疾病。3.2环介导等温扩增(LAMP)Loop-mediatedisothermalamplification针对靶基因的6个区域设计4种特异性引物，利用一种链置换DNA聚合酶在等温条件下(63℃左右)保温30min～60min，使得链置换DNA合成在不停地自我循环，即而完成的核酸扩增反应。4试剂除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯

4、；实验用水符合GB/T6682中一级水的要求。4.1常规试剂4.1.1100mg/mL溶菌酶见附录A.1。4.1.210mg/mL蛋白酶K见附录A.2。4.1.310%十二烷基磺酸钠见附录A.3。4.1.45%十六烷基三甲基溴化铵见附录A.4。4.1.5TE（pH8.0）见附录A.5。4.1.650×TAE缓冲液见附录A.6。4.1.7加样缓冲液见附录A.7。4.1.81.5%琼脂糖凝胶的制备见附录A.8。4.2分子生物学试剂1DB22/T2559—2016BstDNAPolymerase、SYBRGreenⅠ、限制性内切酶TaqⅡ、组织DNA提取试剂盒、血液DNA提取

5、试剂盒、溴化乙锭、DNAMarker分子量标准等。使用或稀释时均参照试剂说明书进行。4.3引物本标准仅供内部使用不得翻印表1LAMP特异性引物序列及浓度引物引物序列引物浓度F3ATGCTTGTGTGGTGAGGC0.2µmol/LB3CAAGTGCCACCCACTGATC0.2µmol/LFIPCGCTGACCGATCGGTTAACTGATTGCCAAACTCAGTGCGT1.6µmol/LBIPTTAGCAGTTGGGGTGTCGGGTACCCTGTTTCGGGAGACA1.6µmol/L4.4标准阳性、阴性对照4.4.1标准阳性样品为犬新孢子虫基因组DNA提取物，D

6、NA浓度为10mg～30mg。制备方法见附录B。4.4.2标准阴性样品健康牛组织DNA提取物，DNA浓度为10mg～30mg。5仪器设备5.1低温高速离心机（12000g以上）。本标准仅供内部使用不得翻印5.2恒温水浴锅（室温～100℃）5.3分析天平（感量0.1mg）5.4电泳槽（水平电泳槽）5.5电泳仪（电压1～300V；电流1～400mA）5.6凝胶成像系统（带紫外灯）5.7微量加样器（单道2μL、10μL、20μL、100μL、200μL、1000μL）5.8其它分子生物学实验设备（振荡器、小型离心机等）6试验步骤6.1样品采集无菌采集流产胎牛脑、肝、脾、肺等组

7、织样品，或牛的血液样品，置灭菌1.5mL塑料离心管中，进行样品处理；或冷冻保存，备用。6.2样品处理待检样品组织DNA或血液DNA的提取，按试剂盒说明书进行。6.3LAMP反应LAMP反应体系：总体系25µL。同时设置阳性对照、阴性对照和水对照。LAMP反应条件：63℃反应60min，80℃2min终止反应。2DB22/T2559—2016表2LAMP反应体系加样物浓度体积本标准仅供内部使用不得翻印DNA模板10～30mg2µLMgSO46.0mmol/L3µLdNTP1.4mmol/L3.5µLF30.2µmol/L1µLB30.2µm