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1、乙肝病毒cccDNA检测方法及临床意义的研究进展作者：李红等单位：四川大学华西医院关键词：共价闭合环状DNA1引言乙型肝炎病毒(HepatitisBvirus,HBV)感染是世界性的公共卫生问题，目前世界范围内有近4亿的慢性HBV携带者，而慢性乙型肝炎是肝硬化和肝细胞癌的高危因素。HBV属嗜肝DNA病毒,□.经证实共价闭合环状DNA(CovalentlyclosedcircularDNA,cccDNA)是HBV前基因纽RNA转录的原始模板，是HBV持续感染和抗病毒药物停用后病情反复的关键因素。根据数学模型推算得出,应用阿徳福韦(Adefovir,ADV)可能需要1415年才能完全清除慢性乙
2、肝患者肝细胞中的cccDNAo因此，了解细胞内HBVcccDNA的存在情况，対深入研究cccDNA在HBV致病机制及药物疗效评价等方面具有重要意义。现就近年來有关cccDNA的常用检测方法及英临床意义等方面的进展作一综述。2HBVcccDNA的生物学特性HBV通过肝细胞胞膜上可能存在的受体入侵肝细胞,在胞质内脱壳，松弛环状DNA(relaxedcircularDNA,rcDNA)进入肝细胞核，在宿主和病毒DNA聚合酶作用下，以负链DNA为模板，延长修补止链DNA裂隙区，完成止链两端连接而形成双链完整的cccDNAocccDNA在复制过程中，可以转录为3.5、2.4、2.1、0.7kb等不同
3、大小的mR-NA,并翻译成为各种病毒蛋白。英中3.5kb的mRNA作为逆转录模板,利用病毒的逆转录酶合成全长的基因纽•负链DNA，再以负链DNA作为模板，通过病毒DNA聚合酶的作用，合成正链DNA,与负链DNA起纽成新的rcDNA,新合成的HBVrcDNA大部分与病毒蛋白装配成新的完整HBV，以芽生方式，从细胞膜上释放至细胞外，再感染健康的肝细胞。另有部分可进入细胞核内，转化为新的cccDNA，补充细胞内的cccDNA池。机体通过免疫淸除HBVcccDNA的途径主耍有:1)通过细胞溶解机制,清除感染的肝细胞，HBV被巨噬细胞吞噬或与抗一HBs抗体结合成为免疫复合物后被巨噬细胞吞噬并从尿中排
4、出。破坏的肝细胞山新生肝细胞替代;2)通过Thl反应介导的依赖细胞因子的非细胞溶解机制，如干扰素、肿瘤坏死因子和白介素一2等细胞因子清除HBV。3HBVcccDNA的主要检测方法以往文献报道较多的cccDNA定量检测的方法是Soulhernblol,该方法是分子生物学的经典方法，检测较为准确，但操作繁琐、敏感性较低II不能准确定量，需标本量也较大，故在临床上应用较少。目前对HBVcccDNA检测的设计多是基于其与rcDNA在结构上的不同:cccDNA两条链均是完幣的,1何rcDNA在止链和负链上均有缺刻或缺口；山于cccDNA双链结构完幣,-■般不会被绿豆核酸酶等核酸外切酶降解,lfUrc
5、DNA可以被这些外切酶降解。3.1巢式聚合酚链反应(Nestedpolymearsechainreaction,nPCR)巢式聚合酶链反应也称套式PCRo山于使用了两对引物并H进行了两轮扩增反应，实验的敏感性和特异性均增强。英引物设计的原理也是基于cccDNA与rcDNA结构的不同，引物跨过环状HBV—DNA的DR1、DR—重复序列旁的两个缺刻。因此,cccDNA能够被扩増,血rcDNA则不能扩増。董庆鸣等用该法检测HBVcccDNA标准对照质粒，结果表明该法可以检测到5×10*5拷贝/LHBVcccDNA。3.2实时荧光定量PCR扩増法He等根据cccDNA与rcDNA在结构
6、和生化特性上的不同，建立了实时荧光定量PCR扩增法。他们将具有发光基团和淬灭基团的TaqMan探针设计于负链缺口的下游，与负链互补。在上游引物的引导下，若负链是完整的，Taq酚则到达Taq-Man探针所结合的位点,利用英5′&nur;3&primc;的外切酶活性将探针切断，从jfu3′端的淬灭基团失去对5&primc;端发光集团的抑制作用，产生荧光信号。相反，若负链含有缺口,山于上游引物引发的链延伸不能通过负链缺口，故不能产生荧光信号。这样,cccDNA和rcDNA得以区分开来。其定量检测的线性范围是1×10*2〜l×10*7拷贝/L。该方法
7、对比分析了HBV基因库中150条已知A2G基因亚型的序列，根据保守区域设计引物,能检测A、B、C、F、G基因型，故该方法可用于90%亚太地区的乙肝病人cccDNA的检测。目前认为该法是临床肝穿刺标本中cccDNA定量的金标准。3.3嵌合引物两步法荧光定量Shao等根据非cccDNA形式的HBV基因组存在缺口,设计由两段序列构成的嵌合引物。其3′端的12个碱基与止链(1604〜1615)互补，结合位点为负链缺口
