Biomics CRISPR Cas9 基因敲除技术.pdf

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1、CRISPR/Cas9基因敲除技术CRISPR（ClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromicRepeats）RNA，是最近几年才发现的原核生物中的调控RNA，用以抵御病毒和质粒入侵。在II型CRISPR系统中，CRISPRRNA（crRNA）与转录激活crRNA（Trans-activatingcrRNA,tracrRNA）退火形成的复合物能特异识别基因组序列，引导Cas9核酸内切酶在目的片段生成DNA双链断裂（double-strandbreaks,DSBs）。CRISPR-Cas系统的高效基因组编辑功能已被应用于

2、多种生物，包括人、小鼠、大鼠、斑马鱼、秀丽隐杆线虫、植物及细菌。多个科研小组的研究都显示，与锌指核酸酶（ZFNs）和转录激活样效应核酸酶（Transcriptionactivator-likeeffectornucleases,TALEN）相比较，CRISPR-Cas系统介导的基因组靶向实验在真核细胞中具有相似甚至更高的效率。Biomics专注于RNA基因调控多年，最新推出基因组编辑工具CRISPR/Cas9专家系统，该系统灵活简单、可以对特定基因组位点进行切割置换，特异性高、细胞毒性低。CRISPR/Cas9系统可广泛应用于基因组工程，如基因抑制，基因敲除，基

3、因敲入，基因修复等。CRISPR-Cas9体系的RNA-DNA识别机制为基因组工程研究提供了一项简便而强大的工具。其最重要的优势是Cas9蛋白可在多个不同的gRNA的引导下同时靶向多个基因组位点，起到多靶点调控的作用。òCRISPR与RNAi的区别目前已经广泛应用的RNAi技术的靶标是mRNA，而CRISPR通过RNA识别DNA序列然后再改变DNA序列，是可以遗传的。由于编码mRNA的DNA序列只占总DNA的极少部分，因此靶向DNA序列的CRISPR的靶标要比RNAi广得多，更有可能筛选出针对某DNA序列的特异CRISPR靶标。作为一种新的基因编辑技术，CRIS

4、PR/Cas9有以下特点和优势：1、操作简单，靶向精确性更高。sgRNA靶向序列和基因组序列必须完全匹配，Cas9才会对DNA进行剪切。编码sgRNA的序列不超过100bp，因此比构建TALENs和ZENs更简单方便，用于CRISPR的sgRNA识别序列仅需20个核苷酸。2、CRISPR/Cas9系统是由RNA调控的对DNA的修饰，其基因修饰可遗传。3、基因修饰率高，基因调控方式多样，例如敲除、插入、抑制、激活等4、可实现对靶基因多个位点同时敲除。5、无物种限制。6、实验周期短，最快仅需2个月，节省大量时间和成本。©Biomics提供以下CRISPR/Cas9专

5、家系统服务1、与客户协商根据靶序列设计RNA序列（3个工作日）；Biomics具有丰富的sgRNA设计经验，提供的序列经过blast，优选脱靶效应最低的序列提交给客户。此外，为进一步提高sgRNA的特异性和降低脱靶效应，我们提供双切口sgRNA对设计（Figure1）。。Figure1.SchematicillustratingDNAdouble-strandedbreaksusingapairofsgRNAsguidingCas9D10Anickases(Cas9n).2、客户根据自身需要选择sgRNA表达载体构建，或sgRNA体外转录合成（构建周期：10个工

6、作日）A、sgRNA表达载体构建,该构建载体为Biomics独有设计策略，连接效率更高，鉴定方法准确便捷。客户可以根据自身需要选择载体构建服务或直接购买试剂盒（PrecutSgRNACloningkit&pSD-gRNAPlasmid）质粒pSD-gRNA专门用于在哺乳动物细胞中表达sgRNA，该质粒含CMV启动子驱动的GFP报告基因表达框，与Cas9表达质粒一起转染细胞即可以完成基因组编辑功能。此质粒由Biomics独立设计含氨苄抗性用于阳性克隆筛选，试剂盒提供预剪切线性质粒，客户可以直接进行连接筛选阳性克隆，降低了客户酶切质粒不完全导致假阳性克隆的出现几率。

7、B、sgRNA体外合成。TM客户可以根据自身需要选择sgRNA合成纯化服务或直接购买试剂盒（T7sgRNAMICscriptTMKIT&EzOmicsRNAQUICKclearKIT-）体外转录的sgRNA与质粒表达的sgRNA相比，更简便快捷，省去了质粒构建的步骤，整个操作过程仅需20h（包括过夜孵育）。转录纯化后的sgRNA可直接进行转染及细胞显微注射。¢sgRNA合成引物（反向引物设计为固定模式，由Biomics提供）¢PCRkit（e.g.pfuDNApolymerase）TM¢T7sgRNAMICscriptKITTM¢EzOmicsRNAQUICKc

8、learKIT-----