DB37T 3317-2018 鸡白血病多重PCR和斑点杂交检测方法.pdf

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1、ICS65.020.30B45DB37山东省地方标准DB37/T3317—2018鸡白血病多重PCR和斑点杂交检测方法Laboratorydetectiontechnologiesofmulti-PCRanddothybridationfordiagnosisofAvianleukosis(AL)2018-06-12发布2018-07-12实施山东省质量技术监督局发布DB37/T3317—2018前言本标准按照GB/T1.1给出的规则起草。本标准由山东省畜牧兽医局提出。本标准由山东省畜牧业标准化技

2、术委员会归口。本标准主要起草单位：山东农业大学。本标准主要起草人：成子强。IDB37/T3317—2018鸡白血病多重PCR和斑点杂交检测方法1范围本标准规定了我省针对禽白血病的诊断检测技术的方法。本标准适用于企、事业单位禽病诊断实验ALV-A/B和ALV-J的检测,判断鸡群是否患A/B、J亚群白血病。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T26436禽白血

3、病诊断技术NY/T680禽白血病病毒p27抗原酶联免疫吸附试验3术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3.1禽白血病AvianLeukosis，AL反转录病毒科甲型反转录病毒属禽反转录病毒引起的以禽类造血组织中某些细胞成分过度增生为主的可传染的肿瘤性疾病，临床症状主要表现为嗜睡、食欲不振、鸡体消瘦、鸡冠和肉髯呈淡紫色，腹部显著增大，胸骨异常隆起。根据病毒囊膜蛋白的抗原性差异、病毒干扰实验、宿主范围等生物学特性，将禽白血病肉瘤病毒群分成A-J共10个亚群，其中A、B、C、D、E和J亚群的宿主是鸡，流

4、行于我国禽群的主要是A、B和J亚群。ALV-J的危害最为严重，目前在鸡群中平均感染率为10%左右，呈现间歇性爆发；ALV-A/B零星爆发，平均感染率在1%左右。J亚群主要诱发髓细胞性白血病，而A/B亚群主要造成淋巴细胞性白血病和肉瘤。禽白血病自发现以来，发病率不断呈上升趋势，在世界各地均有发生，呈世界性分布，是危害养禽业的主要疾病之一。3.2多重PCR技术Multiplepolymerasechainreaction，M-PCR在普通PCR的基础上加以改进,于一个PCR反应体系中加入多对特异性引物

5、，针对多个DNA模板或同一模板的不同区域扩增多个目的片段的PCR技术。3.3斑点分子杂交技术dotblotting是直接从待检鸡只的组织或血液样品提取DNA,将变性的DNA样品点样于硝酸纤维素膜或尼龙膜上，然后与制备的特异性探针进行杂交来检测样品中的前病毒DNA。1DB37/T3317—20184试剂或材料除另有规定外，所有化学试剂均为分析纯。4.1常规使用的商品化的DNA提取试剂盒。4.2常规使用的商品化的RNA提取试剂盒。4.3LB培养基所需胰蛋白胨（Rryptone）、酵母抽提物（Yeast

6、Extract）试剂。4.4MultiHotstartDNAPolymerase(5U/μL)、10×MultiHotstartBuffer(+Mg2+)、Mgcl2（25Mm）、SuperPuredNTP(2.5Mmeach)、PCR琼脂糖凝胶回收试剂盒、RNAprepPure培养细胞/细菌总RNA提取试剂盒。4.5DL1000DNAMarker、PMD18-T载体、6×loadingBuffer、PrimeScriptTMRTMasterMix。4.6禽白血病抗原检测试剂盒。4.7斑点杂交所需

7、溶液。4.7.11M马来酸：见附录A中A.1。4.7.2洗涤缓冲液(马来酸缓冲液)：见附录A中A.2。4.7.3显色缓冲液：见附录A中A.3。4.7.4lMTris-盐酸溶液：见附录A中A.4。4.7.510%SDS（sodiumdodecylsulfate）溶液：见附录A中A.5。4.7.620×SSC（salinesodiumcitrate）溶液：见附录A中A.6。4.7.7封闭溶液（Blocking溶液）：见附录A中A.7。4.7.8抗体溶液：见附录A中A.8。4.7.9预杂交溶液：见附录A

8、中A.9。4.7.10杂交溶液：见附录A中A.10。4.7.11NBT/BCIP显色液：见附录A中A.11。4.7.12探针标记和检测试剂盒（使用Roche公司产品）。4.7.13制备探针所需特异性引物序列：见附录B。4.7.14PT-PCR扩增条件见附录C。5仪器设备5.1各量程移液枪，PCR仪，梯度PCR仪，紫外分光光度计。5.2高速台式冷冻离心机。5.3紫外分析仪。5.4凝胶成像系统。5.5MK3型酶标仪。5.6恒温摇床。5.7恒温恒湿箱、立式压力蒸汽灭菌器、超净工作台。5.