白藜芦醇在酿酒酵母中的组合表达-论文.pdf

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1、白藜芦醇在酿酒酵母中的组合表达孙萍，郭丽琼，梁景龙，林俊芳，黄晓燕，黄佳俊(华南农业大学食品学院，广东广州，510640)摘要将克隆自拟南芥的4el基因和巨峰葡萄的基因，利用降落重叠延伸PCR的方法，成功构建了含有G418抗性筛选标记的酵母表达载体pRS42K-4CL以及含有潮霉素抗性筛选标记的酵母表达载体pRS42H-RS。采用LiAc／SScarrierDNA／PEG法将含有目的基因的2个载体共同转化至酿酒酵母工业菌株EC1118中，通过PCR及酶切鉴定等方法验证重组工程茵。以对香豆酸为底物，将获得的酿酒酵母工程菌于YPD液体培养基中发酵(25℃，150r／min，96h)，发

2、酵液用乙酸乙酯抽提后采用高效液相色谱(HPLC)法进行检测，其结果显示发酵产物中自藜芦醇的含量为0．78mg／L。这表明，拟南芥的4cl基因与巨峰葡萄的基因在酿酒酵母工程菌中成功得到了表达，并且表达产物利用对香豆酸为前体物质合成了目标产物白藜芦醇。该研究为进一步实现白藜芦醇在酵母中的工业化生产奠定了基础。关键词白藜芦醇，酿酒酵母，组合表达，4一香豆酰辅酶A连接酶，白藜芦醇合酶白藜芦醇(resveratro1)是植物在受到生物或非生酶(RS)的研究很多，基因也成功在植物、酵母以及物胁迫时，如真菌感染、紫外照射等，产生的一种能提原核生物中成功表达，但将4cl和rs2个基因同高植物抗病原

3、性攻击和环境恶化的植物抗毒素，主要时转入酵母中并成功合成白藜芦醇的研究尚未见报存在于各种浆果、花生以及药用植物(如虎杖)中。道。白藜芦醇具有抗炎、抗肿瘤、抗衰老以及保护心血管本研究将克隆自拟南芥的4cl基因和巨峰葡萄和调节雌激素等多种保健作用。，可在医药、食品、的基因，分别构建酵母表达载体共同转入酿酒酵化妆品等行业中广泛应用。在自然条件下，植物体内母中实现白藜芦醇的生物合成，为进一步实现白藜芦的白藜芦醇含量非常低，且植物生长缓慢，白藜芦醇醇在酵母中的工业化生产奠定基础。的工业化生产面临着提取难，得率低，成本高等问题。1材料与方法近年来，利用基因工程重组技术在微生物中高效表达白藜芦醇

4、成为研究热点。1．1材料和试剂白藜芦醇在植物体内可经由苯丙氨酸代谢途径1．1．1基因、菌株及质粒生成。苯丙氨酸在苯丙氨酸解氨酶(PAL)及4．羟基4cl基因从哥伦比亚型拟南芥(由华南农业大学羧化酶(C4H)的作用下或酪氨酸在酪氨酸解氨酶生命科学学院陶利珍馈赠)中克隆，基因从巨峰葡(TAL)的作用下生成对香豆酸，生成的对香豆酸在4．萄中克隆；酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)EC1118香豆酰辅酶A连接酶(4CL)的作用下生成4一香豆酰为Lallemand公司市售于酵母；质粒pRS42H及辅酶A。一分子的4一香豆酰辅酶A和三分子的丙二pRS42K由欧洲分子生物

5、学实验室的ChristofTaxis教酰辅酶A在白藜芦醇合酶(RS)的作用下生成白藜芦授和MichaelKnop教授馈赠¨引；大肠杆菌DH5a由醇。目前，国外的研究人员主要是将4cl和2个关本实验室保存。键酶基因引入大肠杆菌或酵母菌中，以对香豆酸为前1．1．2培养基体物质合成白藜芦醇，产量因基因及菌株的不同而有LB培养基：胰蛋白胨10g／L，酵母提取物5g／L，所变化，其在酵母工程菌中的产量最低为1．45NaC110g／L，琼脂粉15g／L(固体)，121oC高压灭菌g／L，最高为391mg／L。国内关于白藜芦醇合20min。抗性筛选时加入氨苄青霉素，终浓度为80mg／L。第～作者

6、：硕士研究生(林俊芳教授为通讯作者．1injf@YPD培养基：酵母提取物10g／L，蛋白胨20g／scau．edu．cn)。国家自然科学基金项目(No．31272217；No．31071837)L，葡萄糖20g／L，琼脂粉20g／L(固体)，121cI=高压收稿日期：2013—04—13，改回日期：2013—07—04灭菌20min。抗性筛选时加入潮霉素和G418硫酸生蔓鲞差塑(篁曼Q塑2l7■图冒蓄幽!!!!!l盐，终浓度均为200mg／L。作用下，按摩尔数比为3：1，16℃连接过夜，转化大肠1．1．3酶和主要试剂杆菌DH5a感受态细胞，提取质粒，酶切鉴定重组质LATaq酶、Ex

7、Taq酶、T4DNA连接酶、各种限制粒。重组质粒命名为pRS42K-4CL。性内切酶等，购自Takara公司；质粒小量提取试剂表达载体pRS42H—RS的构建方法与载体盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒等，购白天根生化科pRS42K-4CL的构建方法相同。启动子TEF1P(B)由技有限公司；pGEM—TEasy载体，购自Promega公司；弓l物P1和弓I物P7—5TCGACTGAAGCCATGGTTGTT—对香豆酸(纯度至98％)购自阿拉丁试剂(上海)有TATGTTC3