农杆菌介导大豆未成熟子叶节的遗传转化-论文.pdf

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1、河北科技师范学院学报第27卷第1期，2013年3月JournalofHebeiNormalUniversityofScience&TechnologyVo1．27No．1March．2013DOI：10．3969／J．ISSN．1672-7983．2013．O1．001农杆菌介导大豆未成熟子叶节的遗传转化钟磊，王林红，乔亚科，崔姗姗，纪展波，李桂兰(河北科技师范学院生命科技学院，河北秦皇岛，066600)摘要：以冀豆7号未成熟子叶节为转化受体，研究外植体取材时间、低温预处理、共培养温度及光照时间对农杆

2、菌介导大豆转化抗性芽的影响。结果表明，以开花后6O一66d进行外植体取材的子叶节产生的抗性芽数量较多；共培养温度26℃，光照时间24h／d有利于抗性芽产生，而外植体4低温预处理不利于抗性芽产生。分析不同品种抗性芽诱导率发现，不同基因型未成熟子叶节抗性芽发生率不同，其中以豫豆22，冀豆7号和品系12的抗性芽诱导率较高。关键词：大豆；农杆菌介导；未成熟子叶节；抗性芽诱导中图分类号：S565．103．52文献标志码：A文章编号：1672-7983(2013)01-0001-04大豆是公认的较难进行遗传转化的

3、植物之一。农杆菌介导的大豆遗传转化是最早被开发出来并且是目前应用最广泛的一种转基因技术⋯，该法具有操作简单，费用低廉，可插入基因片段大，不容易发生重排等优点。农杆菌转化所用的外植体主要有子叶节J、无菌苗的茎尖J、未成熟胚子叶J、上胚轴和初生叶]、子叶¨、成熟胚的胚尖、未成熟胚体细胞胚¨等，而对利用未成熟大豆种子子叶节的转化研究报道则较少。笔者以不同大豆品种的未成熟种子子叶节为转化受体，研究其遗传转化影响因素，为提高大豆遗传转化效率提供依据。1材料和方法1．1材料供试大豆品种：冀豆7号，豫豆22，九农2

4、6，郑97196，品系1O，品系12。植物表达载体：pX6PTF1(河北农业大学张彩英研究员提供)。1．2方法1．2．1外植体的制备选取开花后不同发育时期的大豆豆荚，清水冲洗表面，体积分数为0．75的酒精消毒1min，无菌水冲洗1次，质量浓度为1．0g／L的氯化汞溶液消毒10min，无菌水冲洗3次。无菌条件下取出未成熟种子，灭菌的液体共培养基(或无菌蒸馏水)浸泡15min，去掉种皮，将2片子叶从胚轴纵切，去除幼芽和胚尖。1．2．2茵液制备挑取工程菌的单菌落，接种到链霉素、壮观霉素质量浓度为50mg／L

5、的LB液体培养基中，180r／min，28oC振荡培养2—3d至OD60o=0．6～0．8。随后吸取OD600=0．6～0．8菌液，接种到新鲜的LB液体培养基中，28℃培养至DD600=0．3—0．5。将菌液5000r／rain，4℃离心10min，弃上清，沉淀重悬于与共培养基成分相同的液体培养基中，调整菌液浓度至OD。。=0．3～0．5，备用。1．2．3共培养将制备好的农杆菌菌液侵染外植体30min，接种到共培养基，24。《二恒温培养4d。1．2．4掘}生植株再生共培养后经抗性芽诱导、伸长、生根、移

6、栽和驯化后获得抗性植株。1．3试验设计1．3．1子叶节预处理试验以冀豆7为材料，对所取材料分别进行如下预处理：处理1，对去除荚皮的种子在4℃下处理24h，切制子叶节；处理2，将豆荚在4℃低温处理24h，然后消毒后除去豆荚皮切制子叶节；处理3，取新鲜豆荚直接去荚皮后切制子叶节。基金项目：国家农业部转基因生物新品种培育重大专项(项目编号：2009ZX08004-001B；2009ZX08004-O04B)；河北省自然科学基金项目(项目编号：C2009000868)；河北省科技支撑计划项目(项目编号：112

7、20107D)。通讯作者，女，lg~，教授。主要研究方向：植物分子生物学与基因工程。E-mail：lg163@126．corn。收稿日期：2012-05-23；修改稿收到日期：2013-02-222河北科技师范学院学报27卷1．3．2共培养温度试验以开花60d的冀豆7未成熟种子为材料，共培养温度设置3个处理：22，24，26℃。1．3．3共培养光照试验以开花60d的冀豆7未成熟子叶节为外植体，共培养时设置3个光照长度处理：0，16，24h／d。1．3．4不同品种试验以豫豆22，冀豆7号，郑97196，

8、九农26，品系1O和品系12为受体品种，取开花60d的未成熟种子制备子叶节外植体。每个单因素试验中每个处理切制外植体5O个，3次重复。1．4数据统计分析数据应用DPSv7．05版统计软件进行统计分析。2结果与分析2．1种子成熟度对大豆未成熟子叶节转化抗性芽诱导的影响以冀豆7号为材料，分析开花后50，60，67d未成熟种子子叶节外植体的芽诱导率发现，以开花后60d，种子达到最饱满程度所制备的外植体抗性芽诱导率和平均抗性芽数最高，与开花后50d的和开花后67