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《实时荧光定量PCR检测血浆结核分枝杆菌DNA的初步临床应用3.pdf》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。
1、42临床检验杂志2007年第25卷第1期ChineseJournalofClinicalLaboratoryScience,2007,Vol125,No11文章编号:10012764X(2007)0120042203中图分类号:Q503文献标识码:A·研究生园地·实时荧光定量PCR检测血浆结核分枝杆菌DNA的初3步临床应用1,2111111111严子禾,潘世扬,陈丹,高丽,谢而付,黄佩,戎国栋,杨笛,童明庆,张寄南(1.南京医科大学第一附属医院临床检验中心,南京210029;2.南京医科大学附属无锡市第二人民医院检验科,江苏无锡
2、214002)摘要:目的评价实时荧光定量PCR技术检测血浆(或血清)结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis,MTB)DNA的技术。方法建立实时荧光定期量PCR方法测定血浆MTBDNA,分别检测临床确诊的55例结核病患者血清43份,血浆25份以及非结核肺部疾病患者血清18份,健康体检血清18份和健康体检者血浆11份的MTBDNA含量。结果18例非结核肺疾病患者血清、18例健康体检者血清以及11例健康体检者血浆MTBDNA全部阴性。55例初诊结核患者中10例(18.2%)治疗前血浆(或血清)MTBDNA阳性
3、,在痰涂片阴性的18例结核患者中,血浆(或血清)MTBDNA阳性检出率为27.8%(5/18),其特异性达100%。结论本研究证实了结核患者血浆(或血清)循环MTBDNA的存在,其定量检测对痰涂片阴性及无痰患者的结核病诊断有重要参考价值。关键词:结核分枝杆菌;血浆DNA;荧光定量PCR上世纪90年代末,国内外学者用PCR技术发(AmershamBioscience)、7500荧光定量PCR扩增仪现痰涂片阴性结核病患者外周血单个核细胞中结核(AppliedBiosystems)、琼脂糖凝胶电泳仪(Bio2分枝杆菌DNA(Mycob
4、acteriumtuberculosisDNA,MTBRad)、凝胶成像分析系统(Kodak)、PTC100PCR扩DNA)阳性,并从理论上证明了亚临床结核菌血症增仪(MJ)。[1]的存在。国内外尚未见循环MTBDNA定量检测1.3试剂M7H9液体培养基(OrganonTeknika公的相关报道。本研究建立荧光定量PCR和标准曲司),磁珠法血浆DNA提取试剂盒(上海浩源公线的方法,检测结核病患者血浆(或血清)MTB司),琼脂糖、异丙醇、氯仿(Sigma公司),热启动DNA,并探讨本法的临床应用价值。Taq酶、dNTPs购自大连T
5、akara公司。MTBTaqMan[2]1材料与方法荧光探针和引物合成参照文献,序列如下:上游1.1样本收集2005年5～7月,自无锡市传染病引物:5′2GGCTGTGGGTAGCAGACC23′;下游引物:医院收集确诊为结核病的患者血清(带分离胶促凝5′2CGGGTCCAGATGGCTTGC23′,由上海英骏(in2管,室温3000r/min离心10min,取上清)30例(男vitrogen)公司合成;TaqMan荧光探针:5′2JOE2性27、女性3),其中,20例患者仅有治疗前1份血TGTCGACCTGGGCAGGGTTC
6、G2ECLIPSE23′,由清,7例患者有治疗前后2份血清,3例患者有治疗Takara公司合成;预期产物长度163bp。前后3份血清,血清标本总数43份;同时,收集了非1.4MTBDNA的提取及标准品的制备参照文[3]结核肺疾病患者血清18份和健康体检者血清18献。份。2006年2～4月,自无锡市传染病医院收集确1.5血清(血浆)MTBDNA的提取所收集的79诊为结核病的患者抗痨治疗前的血浆(EDTA抗凝份血清(结核患者43份,非结核肺部疾病患者血清管,室温3000r/min离心10min,取上清),共25例18份,健康体检血清
7、18份)和36份血浆(结核患者(男21,女4);同时收集健康体检者血浆11份。血浆25份,健康体检者血浆11份)按磁珠法操作说1.2仪器Bact/Alert3D全自动细菌快速培养和明书进行DNA的提取。提取的DNA样本置-20药敏检测系统、JY922ⅡD超声波细胞粉碎机、Jouan℃冰箱保存。[3]温控高速离心机、GeneQuantpro紫外分光光度计1.6MTBDNA荧光定量PCR扩增参照文献。3基金项目:江苏省政府“135”重点实验室基金资助项目(SK200205)。作者简介:严子禾,1969年生,女,副主任技师,在职硕士研
8、究生。通讯作者:潘世扬,教授,南京医科大学第一附属医院/南京医科大学第一临床医学院检验系,电子信箱:sypan@njmu.edu.cn/labmed@sohu.com。临床检验杂志2007年第25卷第1期ChineseJournalofClinicalLabor
