虾池沉积物细菌多样性分析和若干可培养技术的优化探讨

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1、第49卷第5期厦门大学学报(自然科学版)Vo1．49NO．52010年9月JournalofXiamenUniversity(NaturalScience)Sep．2010虾池沉积物细菌多样性分析和若干可培养技术的优化探讨蔡莹，李志江，田蕴，郑天凌(厦门大学生命科学学院，滨海湿地生态系统教育部重点实验室，近海海洋环境科学国家重点实验室，福建厦门361005)摘要：为了研究虾池沉积物细菌的多样性，改进培养技术，采用8种培养基培养虾池沉积物细菌，并用变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术对不同培养基平板获得的细菌群落结构进行研究，同时与原位样品的细菌群落结构进行比较．多数细菌在2周内长出，第3周至12

2、周，在VL55、DNB、HMz和DRzA平板上可分离出新的细菌，其他培养基平板上的菌落数目增长不明显．分别使用琼脂和结冷胶作为凝胶剂，结果发现，结冷胶平板和琼脂平板相比，表现出高保湿性、高菌落数和高细菌多样性的特点．变性梯度凝胶电泳(DGGE)分析结果表明，沉积物样品中的优势细菌约6O种，经过不同培养基培养后，得到的细菌多样性为5O种左右，约为原来总数的83％，但是细菌群落结构发生较大改变，优势菌群发生转化．测序结果证明了这一点．虾池沉积物中有着较高的细菌多样性．培养基的改进、结冷胶的使用和培养时间的延长有效提高了虾池沉积物中细菌的可培养性．关键词：虾池；沉积物；细菌多样性；变性梯度凝胶电泳

3、；可培养技术；结冷胶中图分类号：Q93文献标识码：A文章编号：0438—0479(2010)050731—07自然界中的微生物分布广、种类多、资源极其丰型的胶凝剂，替代琼脂使用后，可得到更好的培养效富，据估计其种数高达1O～1O，但能够在实验室培养果．的不足1L1]，大部分还处于未培养、未研究状态．近近年来，我国研究人员对培养技术亦做了许多研年来，研究和开发微生物资源成为研究的热点问题．研究工作．如戴欣等采用稀释培养基对太湖沉积物可培究者通过对培养基和培养方式的改进，从不同的自然养细菌进行研究【1。。，孙风芹等采用改进的培养基从南环境分离得到了多种新的微生物类群．Connon等采用海沉积物中

4、得到87种细菌，分属6个大的类群[n]，叶高通量和寡营养基培养的方法使得近岸海水中微生物姜瑜]、郭斌引、岳秀娟、郑天伦。等亦有相关的可培养比例升至14，远高于传统培养方法n]．Jo—研究论文发表．seph等结合寡营养培养、添加多种生长底物、延长培为研究虾池沉积物中细菌多样性并探索好的培养养时间(3个月)等方法从土壤中获得分属于6O个科、方法，本研究在传统培养方法的基础上结合寡营养培9个门的350株细菌，其中93株为新种[4]．Stevenson养、多种底物的添加、延长培养周期、改良胶凝剂等策等的研究也证实应用寡营养培养基、相对长期的培养、略对虾池沉积物中的细菌进行培养，采用PCR一变性梯添加

5、腐殖酸类物质等措施可以提高微生物的可培养度凝胶电泳(DGGE)技术测定原位环境和培养后的细性-5]．Bollmann等采用原位环境模拟技术从池塘沉积菌群落结构，并引人Shannon—Wiener多样性指数对细物中分离得到184株细菌，分属1O个门，具有极高的菌多样性进行分析．多样性，16SrRNA基因测序结果表明26的菌株属于新种[6]．国外多项研究[4,7-9表明，结冷胶作为一种新1材料与方法收稿日期：2009—12—3l1．1材料基金项目：国家高技术研究发展计划(863计划)(20O8AA09Z4O8)；1．1．1样品采集国家自然科学基金重点项目、主任基金项目和面上项目(40930847

6、，30940002，40876061)；长江学者和创新团队沉积物样品于2007年1月采自泉州东海海水养发展计划项目(40821063)殖池．据泉州市东海区气象局的气候资料统计，该地区*通讯作者{microzh@xmu．edu．ell年均温度为19．8℃，最低为1，2月份，平均温度11．3·732·厦门大学学报(自然科学版)℃．采样的养殖池由晋江与洛江形成的冲积平原上的于7．09kPa负压下用聚碳酸酯膜过滤染色后的样滩涂开发而成，地理位置为：1l8。4lE，24。53N，面积品，待膜抽干后置于载玻片上，滴加镜油，用表面荧光约1．4hm，采用纳潮排污及半精养的养殖管理模式．显微镜(OLYMPUS

7、BX41)进行观察并均匀选择1O选取四角和中央区共5个采样点，取表层2～3cm的个视野拍照，然后统计每个视野中的细菌个数，按下沉积物．样品采集后装入无菌密实袋，置于装有冰块的式计算水样中的细菌丰度：泡沫箱中，立即带回实验室进行细菌分离．细菌总数(mL)一AxS／(S。X)．1．1．2培养基式中，A为10个视野中细菌平均数，S为视野面积，S为滤膜有效过滤面积，为用于计数的液体样共计使用8种培养基：2216E、D