抗TNF-α单克隆抗体治疗豚鼠分泌性中耳炎的实验研究【临床医学毕业论文开题报告】.doc

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1、临床医学论文•抗INF-a单克隆抗体治疗豚鼠分泌性中耳炎的实验硏究【摘要】目的：观察抗TNF-a单克隆抗体对豚鼠分泌性中耳炎的治疗效果。方法：建立分泌性中耳炎的动物模型，随机分成空白对照组、造模组和TNF-aMcAb治疗组三组。比较光镜和电镜下屮耳41因鼓管粘膜的组织形态及处理组1NF・a蛋白含量变化。结果：TNF-aMcAb治疗组中耳、咽鼓管粘膜的组织形态接近于正常对照组，其TNF-a蛋白含量明显低于造模组(pvO.OOl)。结论：抗TNF・a单克隆抗体能拮抗TNF・a的炎症介导作用，对豚鼠分泌中耳炎治疗有效。【关

2、键词】中耳炎伴渗出液；肿瘤坏死因子・a；单克隆抗体；动物模型分泌性中耳炎(otitismediawitheffusion,OWE)是儿童常见病、多发病，其发病机理虽有人量硏究，但至今仍未充分阐明。近年来细胞因子在OME发病中的作用得到阐述与证明〔1〕。TNF-a作为前炎症细胞因子，引起中耳局部细胞因子网络的构建，造成耳及咽鼓管组织炎症损伤，并导致炎症迁延不愈。抗俩・a单克隆抗体(TNF-aMcAb)通过拮抗TNF-a的炎症介导作用，已被运用于因TNF・a过量产生而导致的炎症、损伤等疾病的预防和治疗〔2〕。我们将7NF

3、・&McAb注入OME豚鼠的中耳腔，观察其对中耳咽鼓管粘膜组织形态的影响及TNF・a蛋白表达的变化，以期获得一种新的治疗途径。1资料与方法1.1实验动物及分组：白色豚鼠由广东医学院实验动物中心捉供，体重250〜300g，共52只，普通级‘雌雄兼用。将实验动物随机分为三组：空白对照组，4只（8耳）；OME造模组，24只（24耳）；7NF・aMcAb治疗组，24只（24耳）。1・2模型建立：豚鼠OME模型建立参照Jcon等〔3〕造模法,将豚鼠置于专制的豚鼠固定盒内，头颈露于盒外，耳显微钳清理外耳道，耳内窥镜检查后，75%

4、酒精消毒外耳道，电耳镜暴露鼓膜，直视下鼓膜前下方穿刺向鼓室内注射2mg/kg铜绿假单胞菌LPS溶液（购自武汉博士德公司）50“LoTNF・aMcAb治疗组在SOM模型建立同时将TNF・aMcAb（购自武汉博士徳公司）5mg注入中耳腔。豚鼠分别在造模后1、3、7、14、21、28d断头快速处死（造模组和TNF-^McAb治疗组每次处死4只，空白对照组在28d统一处死），取大鼠双侧中耳粘膜及咽鼓管组织分成两部分，一部分30mg组织放入0・2ml无水乙醇的匀浆器中制成匀浆，44°C1200r/min离心20min，取上清液

5、酸化，再离心后取上清液，放置・4（TC冰箱中保存待测。另一部分用10%的甲醛和25%戊二醛溶液灌注固定，制作光镜和电镜标本5光镜、扫描电镜观察。1.31NF-6T蛋白表达：采用放射免疫法测定INF-a蛋白含量。按试剂盒说明书的步骤进行操作，TNF・a放射免疫试剂盒购自北京东亚免疫技术硏究所，放射免疫计数器购自美国PE公司。1.4统计学方法：采用SAS8.12软件进行统计分析，运用成组设计t检验进行组间差异的比较。2结果2.1组织形态学检查2.1.1正常对照组：光镜下咽鼓管粘膜层薄，纤毛排列整齐。电镜下咽鼓管近鼓室段纤

6、毛细胞的纤毛排列整齐，朝向鼻咽侧。2.1.2OME造模组：光镜下咽鼓管粘膜层增厚，腺体增生，粘膜表面有无结构的红染物覆盖。电镜下与正常对照组相比训因鼓管纤毛细胞的纤毛排列紊乱，可见杯状细胞。2.1.3TNF・aMcAb治疗组：光镜下与造模组相比，咽鼓管粘膜层变薄，纤毛排列稍紊乱。电镜下与造模组相比，咽鼓管纤毛细胞的纤毛排列较有序，纤毛朝向鼻咽侧。2.2WF-a蛋白的表达：OME造模组和W-6zMcAb治疗组TNF・a蛋白含量的变化见表1。ONE造模组TNF-a蛋白的表达在造模后第Id出现一小高峰，之后在7d又逐渐上升

7、，在第14d达到高峰，21、28d仍保持高表达。TNF-aMcAb治疗组TNF-a蛋白含量的变化曲线与造模组相似，但14d后维持于较低水平。两组间不同时间的TNF-a蛋白含量的均数比较均有显著的统计学意义，McAb治疗组时・a蛋白表达明显低于OME造模组。表1OME造模组与TNF-aMcAb治疗组TNF-a蛋白含量的变化（略）3讨论近年来许多硏究表明，分泌性中耳炎存在免疫功能紊乱，并与体内多种炎性介质或细胞因子有密切关系〔1〕。7NF・a主要由巨噬细胞和活化的T细胞产生，细菌脂多糖、内毒素、病毒可诱导其产生。TNF・

8、a为前炎症细胞因子，构成炎性反应的急性期，使免疫系统快速进入活性状态，并促使其它细胞因子释放，引起中耳粘膜水肿、血管扩张、抑制纤毛运动及促使上皮过度增生。临床检测已经证明，OME患者中耳积液中TNF-6Z的含量明显增高，且与病情的反复及迁延相关〔4,5〕。Smirnova等〔6〕的硏究还发现，TNF-a可在体内激活一氧化氮合成酶增加氧的合成,后