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1、大鼠心肌细胞原代培养实验二大鼠CM的体外分离、培养及鉴定1＞材料与方法1.1材料1.1.1实验动物新生3天清洁级Wistar大鼠乳鼠(中国医学科学院放射医学研究所实验动物中心，动物许可证号：scxk2005-0001)o1.1.2主要仪器与试剂5%CO2恒温培养箱(modelTC2323C02incubator)；倒置相差显微镜(XD-10198010)；PhH+(mettlertoledo320-s)；立式自动电热压力蒸汽灭菌器(LDZX・40BI),上海申安医疗器械厂；SW-CJ-2FD型单人
2、双面净化工作台；微量移液枪(法国Gilson)；血球记数板(上海市沪江医疗器材经营部)；HH-6数显恒温水浴锅；离心机(LDZ5-2)；75cm2培养瓶、50ml离心管(美国corning公司)；无菌手术器械；磁力搅拌器；电子天平板(BS1101S德国)；一次性滤器(22Um,GILSON)；DMEM/F12培养基(美国GIBCO)；特级胎牛血清(FBS,Hyclone)；青、链霉素(Hyclone)；D-Hank?s液(NaCI、KCI、Na2HPO4、KH2PO4、NaOH、NaHCO3,苯酚
3、红,南京化学试剂厂)；心肌肌钙蛋白T(Santacruz);FITC连接的兔抗山羊lgG(Santacruz);II型胶原酶、胰蛋白酶⑸gma)；Triton-X-100(AMRESCO);BrdU(solarbio)o1.2方法于无菌操作下开胸取出心脏，仔细去除心脏相连大血管和心房组织（留心尖部），于4°C的D-Hank,S液中漂洗3〜4次，以去除残存血液，眼科剪将心尖部组织剪成1mm3碎块后,加入4ml的0.0625%胰蛋白酶液，于37°C恒温水浴箱中消化3min,然后弃上清。于剩余沉淀中加入
4、混合消化液5ml（0.0625%胰蛋白酶+0.1%II型胶原酶），置37°C水浴消化8〜10min,其间振荡2~3次，静置后将上清液移入离心管屮，加含10%胎牛血清预冷的DMEM/F12培养液终止消化。随后用上述方法反复消化7~8次至组织块基本消化完毕。收集各次上清液并终止消化后，200H的尼龙网筛过滤去除残留组织块，以1000r/min速度离心8min,将所得的细胞与培养液混悬后，采用差速贴壁分离法去除心肌成纤维细胞每次2h,将未贴壁的心肌细胞悬液吸出，调整细胞密度接种于培养板中。培养前3d加入
5、0.1mmol/LBrdU抑制成纤维细胞生长。48h首次换液，以后根据情况2〜3d换液。1.3CM的鉴定弃除培养基，PBs平衡盐缓冲液漂洗3次，以.20°C预冷的4%多聚甲醛固定30min,PBs平衡盐缓冲液漂洗3次后,O.5%tritonx-100穿孔15mino10%正常兔血清（以PBS平衡盐缓冲液稀释）封闭30min后，分别加入抗肌钙蛋白抗体T（cTnT）（分别以PBS平衡盐缓冲液4100稀释）4°C过夜，再兔抗羊FITC-IgG室温孵育2小时，每个步骤间均以PBs平衡盐缓冲液漂洗3次，每l
6、Omin,甘油封片，荧光显微镜激发照相。2.结果2.1心肌细胞的形态在倒置相差显微镜下观察，刚分离的心肌细胞呈圆形，培养2h后成纤维细胞基本完全贴壁，而少数心肌细胞8h左右开始贴壁，少数贴壁的单个心肌细胞出现了自发性搏动，搏动的频率、节律各不同。24h后搏动的心肌细胞百分率大约为50%,搏动频率较分散，约30—50次/min。至48h视野下细胞呈梭形，板形，三角形或扁平不规则形，折光度较高，细胞屮隐约可见细胞核，搏动的心肌细胞百分率大于90%,搏动频率多集屮在50〜80次/min,72h后细胞充分
7、铺展，贴壁牢固，少数局部呈均一搏动频率，可达80〜100次/min（附图7-8）o2.2CM的鉴定在免疫荧光染色时一抗选用羊抗大鼠心肌特异性肌钙蛋白T的单克隆抗体，二抗选用FITC标记的山羊抗小鼠IgG,心肌细胞屮胞浆呈绿色荧光则显示心肌肌钙蛋白T在胞浆中的表达（附图9）。3小结本研究通过用改良的新生小鼠心肌细胞培养方法，心肌细胞存活率高,心肌细胞和非心肌细胞分离较彻底，细胞贴壁快、搏动早、纯度高，且操作简便，重复性好，是一种较为理想的心肌细胞原代培养方法，可以满足心血管疾病发生、发展机理及心血管
8、药物和心脏组织工程学的研究及多种生理生化实验的耍求.
