实验一 巨噬细胞培养.doc

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1、实验一巨噬细胞培养实验目的实验一腹腔巨噬细胞培养掌握巨噬细胞培养基本过程实验前准备一、材料成年大鼠1＞无菌材料（1）手术器械：解剖剪、解剖银、止血钳。（2）消毒用品：碘酒棉球、酒精棉球、酒精灯。（3）其他用品：注射器、培养皿、离心管、吸管。（4）刺激剂：4%硫代乙酸钠，煮沸灭菌。（5）清洗液:HBSS和不含Ca2+和Mg+的HBSS。（6）培养液：DMEM加血清。二、操作程序，以成年大鼠腹腔取材，其法如下：1、实验前4天，向大鼠腹腔内注入无菌硫代乙酸钠5-10ml（勿注入肠内！），以刺流产生大量

2、的巨噬细胞。2、引颈处死大鼠，经颈总动脉放血。将动物仰置，剪去腹壁皮毛，用70%酒精消毒。3、沿正中线剪开腹部皮肤，但勿伤及腹膜壁，把皮肤拉向上下两侧，暴露出腹膜壁，剪开腹壁。4、注射器吸5-10mlHBSS液注入腹腔中，同吋用吸管反复冲洗腹膜腔的细胞，从两侧压揉腹膜壁，使液体在腹腔内流动。6、吸出使腹膜腔中细胞悬液，置空白管中，离心（1000r/min,10min）o然后，HBSS混悬细胞，重复离心1次。7、去上清，先加lml培养液混悬沉淀细胞，反复吹打200次左右（动作要轻，尽量不产生气泡）

3、（接种一小滴于培养皿中镜下观察细胞密度，如果密度过大，多加培养液稀释，将细胞稀释到目的浓度，如果细胞数量少,稍加培养液稀释即可种到培养皿中，先接种中间，按一定方向接种，注意不要接种在边缘，平铺，不够，添加适量培养液），培养2h。8、吸除去培养液，可去除其它白细胞，纯化培养细胞，用不含Ca2+和Mg+的HBSS清洗2次，再加新培养液培养液置CO2温箱中。三、结果分析巨噬细胞刚贴壁吋偏圆形，20min后慢慢伸出伪足，铺开呈三角形或多角形。此次实验结果巨噬细胞活力不好，有污染出现，可能原因1）取材过程

4、无菌概念不强；2）腹腔注射药物影响；3）细胞接种过程污染；4）培养液可能存在问题；5）培养箱问题。减少污染：1、严格无菌操作2、大鼠皮肤严格消毒3、碘酒消毒腹部皮肤，酒精绵球脱碘。用手术直剪充分剪开腹部皮肤，暴露腹部肌层，再用酒精绵球消毒腹部肌层。用注射器抽取lOmLHBSS液注入腹腔，用绵球轻揉腹部1-2min,然后，用眼科辍稍提起腹腔，并用眼科剪剪开一个小口，用吸管吸取细胞悬液，移入离心管中（个人认为，此法比用注射器抽吸好一些）。4、吸管吸取细胞悬液的时候，尽量不耍吸到大小肠，否则容易引起成

5、纤维细胞污染。第二天：1•去废液（冲洗，铺开）2.PBS冲洗1次3•加培养液培养跨膜实验1•去废液2.PBS洗3次3.0.25%胰酶消化lmin,离心lOmin,1000转，去上清4.加培养液适量（0.5ml）,吹打5.接种于膜上，呈三角形，三点，边缘，镜下观察6.下室加适量培养液（可以在原位滴加，也可平移一位，先加培养液,移位）7.下室加入lulMCP（粒细胞趋化因子）8.入37co2培养箱9.18小时后取出