巨噬细胞培养.doc

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1、巨噬细胞培养测体外培养的巨噬细胞的吞噬能力的实验可以采川吞噬小性红的方法及墨汁吞噬试验,具体如下（在无其它刺激的条件下或刺激完成后进行如下步骤）：1・吞噬中性红的方法:取制备的24孔或96孔板M4）单层,然后向每孔加入0.1%的中性红生理盐水液,继续培养20min,倾去上清液，用温PBS洗3遍，去除未被吞噬的屮性红颗粒，每孔加入细胞溶解液（乙酸：无水乙醉二50：50）0.2ml,室温下放置2〜3h,待细胞溶解后，即在酶标仪上测波长540nm处的吸收度A,加培养基作为对照组。2.墨汁吞噬试验的方法：将巨噬细胞用PBS洗2次后,调细

2、胞密度为5X105ml-1,每0.1ml加入滤纸滤过的优质墨汁10ylo37°C温育30min或4h,洗去游离墨粒，丿11片，壮ight's染色，油镜下计数胞浆屮吞有大小墨粒5个以上的阳性细胞。巨噬细胞培养乜噬细胞属免疫细胞，有多种功能，是硏究细胞吞噬、细胞免疫和分子免疫学的重要对象。巨噬细胞容易获得，便于培养，并可进行纯化。巨噬细胞属不繁殖细胞群，在条件适宜下可生活2-3周，多用做原代培养，难以长期生存。巨噬细胞也建有无限细胞系，人多来自小鼠,如P331、S774A.kRAW309Cr.1等,均获恶性，培养中呈巨噬细胞形态和吞

3、噬功能，易于传代和瓶壁分离，但难以建株。培养巨噬细胞可川各样方法和各种來源来获取细胞，以小鼠腹腔取材法最为实川，其法如下：1.实验前三天，向每只小鼠腹腔内注入无菌硫梵乙酸肉汤51（勿注入肠内）。2.引颈杀死动物，手提鼠尾将全鼠浸入70%酒精小3〜5秒。3.置动物于解剖台上，用针头固定四肢，双于•持银撕开皮肪拉向两侧，暴露出腹膜,但勿伤及腹膜壁。4.再用70%酒粘擦洗腹膜壁后，用注射器吸10mlEagle液注入腹腔屮，同时从两侧用手指揉压腹膜壁，令液体在腹腔内充分流动。5.用针头轻轻挑起腹壁，使动物体微倾向一-侧，使腹腔中液体集于

4、针头下吸取入针管内。6.小心拔出针头，把液体注入离心管中，1000g4°C离心10分钟，去上清，加10mlEagle培养基。7•计数细胞,每只小鼠可产生20〜30X105细胞，其中90%为巨噬细胞。8.为获取3X105个帖附细胞/平方厘米，需接种2.5X106/mlo9.为纯化培养细胞，去除其它门细胞，接种数小时后，去除培养液，用Eagle液冲洗1〜2次后，再加新Eagle培养液置37°CC02温箱屮培养。小鼠腹腔巨噬细胞的制备1.小鼠颈椎脱臼处死，75%酒精浸泡3分钟，取出小鼠，置于无菌纸上，腹血朝上；2.用铁子提起小鼠下腹部

5、皮肤，剪开一小」撕开皮肤，完全暴露腹膜；3.10ml注射器装上大号针头,注入6mlHanks液或PBS,用银子提起腹膜,向腹腔中注入Hanks液，针尖朝上，避开肠和脂肪，冋抽腹腔液，不同方向冲洗数次，吸出腹腔液；4.细胞悬液离心200Xgl0分钟,用Hanks液洗一次,用RPMI1640-5%小牛血清悬起细胞，2X106细胞/ml；5.细胞悬液置入培养瓶，37度培养2小时后，吸弃上清，用预热培养基洗二次，留下贴壁细胞；6.含10mMEDTA的PBS加入培养瓶，覆盖细胞，37度孵育20分钟，用吸管用力吹打下细胞，或用橡皮擦帚轻轻刮

6、下细胞，即为腹腔巨噬细胞，纯度一般人于90%,每只小鼠平均可得2X106腹腔巨噬细胞。注：1.雌性小鼠6-8周最适用。雄性小鼠肠壁脂肪多。不利于腹腔液收集；2.在冲洗过程屮应小心，以免刺破血管或肠壁，血液流入腹腔液；3.吸出的腹腔液应洗后再贴壁，否则有血浆膜形成，影响贴壁；4.贴壁巨噬细胞分离有较多方法，如利多卡因孵育等，但人多不够理想，故细胞分离后应用台盼兰染色检测活力；5.橡皮擦帚可自制，用口行车气门芯上的橡皮管套在预先折弯的滴管尖头上，灭菌后使用，较为实用；6.炎性巨噬细胞的制备可用3%的脱水硫梵乙酸培养基2nd,注入小鼠

7、腹腔，4天后同法由集腹腔细胞，每只小鼠腹腔细胞产量可以增加到3X107细胞左右。需指岀的是炎性巨噬细胞的功能活性与正常腹腔巨噬细胞有很大差异。巨噬细胞的纯化1）川帖壁法纯化巨噬细胞1•用含20%〜40%小牛血清的RPMI-1640培养液将巨噬细胞配成2X106〜4X106/ml的浓度。以每平方厘米2X105〜4X105个巨噬细胞的密度将细胞悬液接种到玻璃培养1U1（瓶）或塑料培养皿（瓶）中。37°C5%CO2的饱和水汽二氧化碳培养箱屮培养1小时或24小时。1小时培养节省时间但会丢失一些粘附力弱的巨噬细胞，而24小时可以得到较多的

8、巨噬细胞。20%〜40%的小牛血清可以减少B淋巴细胞的粘附。2.摇晃培养1111（瓶），悬浮未粘附细胞，吸出细胞悬液。用预温的H^nks液洗涤细胞3〜4次。悬浮细胞可重复粘附，得到更多巨噬细胞。川适量含2.Smmol/LEDTA的无钙镁Hanks液消化细胞37°