碘离子对烟草过氧化物酶Ⅰ(TOPⅠ)的荧光猝灭的研究.pdf

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1、第25卷，第2期光谱学与光谱分析Vol.25，No.2，pp239-24l2005年2月SpectroscopyandSpectralAnalysiseebruary，2005!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!碘离子对烟草过氧化物酶!（TOP!）的荧光猝灭的研究夏炳乐l，彭敦耕l，李敏莉l，肖洪2，王开保3l.中国科学技术大学化学系，安徽合肥2300262.驻马店卷烟厂，河南驻马店4630003.芜湖卷烟厂，安徽芜湖24l000摘要通过对碘离子（I-）与

2、烟草过氧化物酶!（TOP!）作用前后的荧光光谱的分析，并运用改良的Stern-Volmer方程处理数据；计算得到I-离子与TOP!上的色氨酸残基的结合位点数及结合常数，讨论了它的荧光猝灭机制和色氨酸残基在TOP!分子中的分布情况。主题词烟草过氧化物酶!；猝灭机制；结合位点数；结合常数中图分类号：@5l文献标识码：A文章编号：l000-059（32005）02-0239-03过氧化物酶（Peroxidase，ECl.ll.l.l7）是一种在生物体内广为分布计（上海雷磁仪器厂）；微量进样器（上海医用激光仪器厂），的一种蛋白质，多含有血红素辅基，它可以在过氧化氢的作用下催

3、化BP2llD型电子天平（德国Sartorius公司），Eppendorf可调移液氧化一系列底物。烟草过氧化物酶（Tobaccoperoxidase）属于植物过氧化管（德国产）。物酶超家族。按照一种来源分类方法，它属于"类过氧化物酶，是一种K（IGR级），Milli-@超纯水；其他试剂为国产分析纯试分泌型酶，同样属于此类的还有如辣根过氧化物酶（Hoseradishperoxi-剂。［l］。dase）及花生过氧化物酶（Peanutperoxidase）等1.2TOP!的制备由于过氧化物酶在酶的构建、免疫测定技术以及药物诊断技术上按照文献方法［4］获取烟草过氧化物酶!纯

4、蛋白。的具有广泛应用的潜力和前景，并且具有较为一致的性质和许多灵敏1.3实验方法的比色分析方法，使得它在基因学、生理学、病理学以及其他学科的研究中发挥了重要的作用［l］。烟草过氧化物酶除了具有以上方面的作用l.3.l普通荧光光谱的测定外，还对烟草本身的抗病性及品质产生重大的影响，具有潜在的经济采用日立850型荧光分光光度计，荧光池光径为lcm，价值和科研价值［l，2］。激发和发射狭缝（带通）均为5nm，激发波长为280nm时，滤荧光光谱法具有较高的灵敏度，可以有效的研究蛋白质在水溶液光片（EMfilter）波长采用3l0nm；激发波长为295nm（Trp荧中的分子构

5、象。通过荧光猝灭研究还可以揭示荧光发色基团在蛋白质光）时，滤光片波长采用350nm，扫描速度60nm·min-l，蛋中的位置和数目［3］。白质浓度为l.0·L-l。#mol本文在对烟草过氧化物酶同工酶!（Tobaccoperoxidase!，TOP!）l.3.2KI对TOP!的荧光猝灭实验进行分离纯化的基础上，分析了I-离子猝灭TOP!的荧光机制，并根用pH6.0，0.02mol·L-l的Tris-HCl的缓冲溶液配制据改良的Stern-Volmer方程求出I-和TOP!中色氨酸（Trp）残基的结合-l的TOP!，然后用2mol·L-l6#mol·LKI进行滴定，激

6、发波位点数，在此基础上得出TOP!中的5个Trp残基在分子内的分布情长均为295nm，分别在各自最大发射峰位测定荧光强度的变况。化。l实验部分2结果与讨论1.1仪器与试剂850型荧光分光光度计（日本日立公司），pHS-2C型酸度2.1TOP!的荧光光谱在PH6.0，0.02mol·L-lTris-HCl缓冲液条件下，测得TOP!的!ex，max=278.9nm，!em，max=340nm，而游离的Trp收稿日期：2003-09-23，修订日期：2004-02-06基金项目：国家烟草专卖局资金项目（l00200l0l04l）资助!ex，max=278nm，!em，ma

7、x=355nm。在相同情况下，!ex=作者简介：夏炳乐，l963年生，中国科学技术大学化学系副教授，博士278.9nm时，TOP!和纯的色氨酸溶液的内源荧光光谱谱形24O光谱学与光谱分析第25卷非常相似（见图1），TOP!的荧光发射峰显示最大发射波长发FO/F=1+Kg#［O0］=1+Ksv［0］生15nm的光谱蓝移。!em，max的较大蓝移表明，TOP!分子中式中FO，F分别是添加猝灭剂0前后时的荧光强度，［0］为部分Trp残基可能位于疏水环境中［2，5］。猝灭剂浓度，K为双分子猝灭过程的速率常数。#为没有猝gO灭剂时荧光物质的荧光寿命，Ksv为动态猝灭常数。