海洋环境来源的淀粉酶对生玉米淀粉的降解特性_彭惠

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1、中国生物工程杂志ChinaBiotechnology，2012，32(7):79-83海洋环境来源的淀粉酶AmyP对生玉米*淀粉的降解特性＊＊彭惠雷寅刘源涛汪颖(安徽大学生命科学学院安徽省微生物与生物催化工程技术研究中心合肥230039)摘要来自海洋宏基因组文库的α-淀粉酶(AmyP)属于最新建立的糖苷水解酶亚家族GH13_37。AmyP是一个生淀粉降解酶，能有效降解玉米生淀粉。在最适反应条件pH7．5和40℃下，生玉米淀粉的比活达到(39．6±1．4)U/mg。酶解反应动力学显示AmyP可以非常快速的降解生玉米淀粉。对1%的生玉米淀粉降

2、解仅需要30min;4%和8%的生玉米淀粉只需3h。DTT可以显著提高AmyP对生玉米淀粉的降解活性，1%DTT促使活性增加1倍。根据电镜观察和产物分析，认为AmyP是以内腐蚀的模式降解生玉米淀粉颗粒，释放出葡萄糖、麦芽糖和麦芽三糖作为终产物。关键词α-淀粉酶生玉米淀粉糖苷酶家族GH13_37酶解中图分类号Q556淀粉降解在人类生活中占有举足轻重的作用，数通过探索底物利用情况，发现AmyP是一个生淀粉降解以千计的食品、制药、造纸和燃料等产品与淀粉降解直酶，能够有效的降解生玉米淀粉。本文报道AmyP对生［1］接相关。天然生淀粉是一种结构复杂

3、而致密的颗玉米淀粉的降解研究，为了解这个新的亚家族成员的粒，在应用前往往需要通过强酸、碱、高温或者酶法破独特催化特性以及开发新型的酶制剂奠定基础。［2］坏生淀粉颗粒的结构。酶法降解生淀粉显然更加环1材料与方法保并节约能耗，因此生淀粉降解酶的研究一直受到高度关注。1．1材料α-淀粉酶(α-amylases，E．C3．2．1．1)隶属于糖苷重组表达载体pET32a-AmyP由本实验构建［6］，转水解酶13家族(GH13)，是最重要的淀粉降解酶之一。化大肠杆菌BL21(DE3)后，16℃诱导表达，AmyP蛋白只有少数的α-淀粉酶具有生淀粉降解活

4、性，而且其中通过Ni2+亲和层析一步纯化。生淀粉购自河北赵州利［2-3］的绝大多数来自于陆地生物。目前为止只有两个民淀粉企业集团总公司和安徽燕之坊食品有限公司。来自海洋细菌的α-淀粉酶被报道具有生淀粉降解活寡糖标准品等购自Sigma-Aldrich公司。0．2mm的G60［4］性，分别来自Bacillussp．ALSHL3和B．aquimaris硅胶板购自青岛海洋化工有限公司。3，5-二硝基水杨［5］MKSC6．2。最近，我们从海洋宏基因组文库中筛选酸等化学试剂均为分析纯。获得了一个新型的α-淀粉酶(AmyP)，并在此基础上发1．2测定生

5、玉米淀粉降解活性和蛋白质浓度［6］现了一个新的糖苷水解酶亚家族GH13_37。AmyP采用3，5-二硝基水杨酸(DNS)法测定生淀粉降解的氨基酸序列与已知的α-淀粉酶相似性极低(不超过［7］［8］后释放出的还原糖的量，以葡萄糖为标准。一个20%)，而且又具有新型的进化地位，因此，探索AmyP标准反应体系包含100μl适当稀释的纯酶和500μl4%是否具有某些独特的催化特性具有重要的科学价值。(m/V)生玉米淀粉(或者其它生淀粉)。酶和淀粉均配收稿日期:2012-05-05修回日期:2012-05-15置在100mmol/L磷酸钠钾缓冲液(

6、pH7．5)中，在40℃*安徽省自然科学基金(11040606M65)、安徽省高等学校省级自然科学研究重点项目(KJ2012A017)资助项目反应3min，立刻置于冰冷的0．3mol/LNa2CO3溶液中＊＊电子信箱:pph0259@126．com［9］终止反应，随后4℃8000g离心5min，取上清测定还80中国生物工程杂志ChinaBiotechnologyVol．32No．72012原糖的量。生淀粉使用前用MilliQ水洗涤5次，除去可AmyP对温度比较敏感。低于40℃或者高于50℃时，能的还原糖。一个标准酶活单位(U)定义为每分钟

7、释酶活急剧下降。40～50℃酶活较为稳定，保留了95%放出1μmol还原糖所需的酶量。蛋白质浓度采用以上的活性。此外，以可溶性淀粉为底物时，AmyP的［6］Bradford法测定，牛血清白蛋白作为标准蛋白。最适pH和温度分别为6．5℃和50℃。这种最适pH1．3温度、pH和DTT对生玉米淀粉降解活性的影响和温度随底物的不同而出现“漂移”的现象曾经在三个在40℃测定不同pH对生玉米淀粉降解活性的影来自Corticiumrolfsii的葡萄糖淀粉酶(糖化酶)中也有［12］响。缓冲液为100mmol/L磷酸钠钾缓冲液(pH5．0～类似报道。该现

8、象说明不能简单的采用可溶性淀粉8．0)和100mmol/L甘氨酸-NaOH缓冲液(pH8．5～9．为底物时的最适反应条件来降解生淀粉。在最适条件0)。在最适pH7．5下测定温度对降解活性的影响