HTPP-MDC原核表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达.pdf

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1、2012，VoI．29No．5亿与生物互程Chemistry&Bioengineeringdoi：10．3969／j．issn．1672—5425．2012．05．005HTPP—MDC原核表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达卢雪梅．一。黄演婷-一，金小宝，汪洁，朱家勇(1．广东药学院药用生物活性物质研究所，广东广州510006；2．广东省生物活性药物研究重点实验室，广东广州510006)摘要：通过双酶切、连接、转化等方法将肝靶向穿膜肽一家蝇天蚕素(HTPP—MDC)融合基因克隆至原核表达栽体pET32a(+)上，构建重组表达质粒HTPP-MDC／pET32a。

2、重组质粒转化E．coliBL21(DE3)后，以IPTG诱导，sDPAGE分析表明重组融合蛋白得到了可溶性表达，Westernblot杂交证实了表达蛋白的抗原活性。为HTPP—MDC的生物学活性研究及产业化开发奠定了基础。关键词：肝靶向穿膜肽；家蝇天蚕素；融合基因；原核表达中图分类号：Q786文献标识码：A文章编号：1672—5425(2012)05—0016—03乙型肝炎病毒(HepatitisBvirus，HBV)主要在广泛应用J。肝细胞内寄生和复制，导致急慢性乙型肝炎的发生，甚作者在此利用基因重组技术将目的基因亚克隆入至引起肝硬化和肝癌[1]，目前临床上

3、用于抗HBV的原核表达载体pET32a(+)中，构建重组原核表达质药物无组织和器官选择性，疗效不够理想。作者在前粒，通过大肠杆菌表达，采用SDS—PAGE和Western期研究中将肝靶向穿膜肽(Hepatocyte—targetingandblot对表达产物进行检测与鉴定，拟为HTPP-MDCpenetratingpeptide，HTPP)与家蝇抗菌肽天蚕素的生物学活性研究及产业化开发奠定基础。(Muscadomesticacecropin，MDC)融合，构建的肝靶1实验向穿膜融合多肽HTPP—MDC有望成为定位准确、高效结合、竞争性阻断和靶向杀伤的新型抗HB

4、V药物，1．1材料与试剂对降低乙型肝炎病毒感染引起的肝脏疾病的发病率和宿主菌E．coliDH5a、E．coliBL21(DE3)，质粒死亡率具有深远的意义。HTPP—MDC／pMD20一T，自行保存；质粒pET3．2a但如何低成本、大量获得多肽类药物以满足其(+)，Novagen公司；限制性内切酶Kpn工、HindⅢ、开发与应用的需求是科研工作者积极探索的课题。TDNA连接酶、TaqDNA聚合酶、DNA分子量标目前，多肽类药物的来源主要有以下几种：(1)直接准，TaKaRa公司；TIANgelMidiPurificationKit、从生物体分离纯化，由于数量太

5、少且成本太高，作为TIANpureMidiPlasmidKit，北京TIANGEN公司；应用开发几乎是不可能。(2)根据蛋白质的氨基酸蛋白质分子量标准，Fermentas公司；丙烯酰胺、N，序列，进行人工合成，也存在成本高、活性低等一系N一亚甲基双丙烯酰胺、SDS，Sigma公司；TEMED，北列问题_2]。(3)利用基因工程技术生产，该领域的飞京鼎国生物公司；6×HisTag小鼠单克隆抗体、HRP速发展为低成本多肽类药物生产提供了一种可持续标记的山羊抗小鼠IgG抗体，美国Pharmacia公司；方案。通过基因重组技术，可大量高效地生产多种DAB显色试剂盒，武

6、汉博士德公司；其它化学试剂为生物活性多肽如干扰素、生长因子等，在肿瘤、乙肝、进口或国产分析纯。神经系统疾病、创伤以及艾滋病等治疗领域得到了1．2表达载体的构建基金项目：国家自然科学基金资助项目(30671832)收稿日期：2012—02—21作者简介：卢'~(1978一)，女，江西宜黄人，助理研究员，主要从事药用生物活性物质结构、功能与应用研究，E-mail：1uxuemi6O5@163．com；通讯作者：朱家勇，教授，博士生导师，E-mail：zhujy@gdpu．edu．en。卢雪梅等：HTPP-MDC原核表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达／2012年囊5

7、期以质粒HTPP-MDC／pMD20-T为模板，用上游取重组质粒HTPP—MDC／pET32a转化后的E．coli引物P1：5r_CGGGGTACCGACGACGACGACAAGAA—BL21单菌落培养并进行菌液PCR，初步鉴定为阳性TAGTCGTTCACTTG-3和下游引物P2：5，_CCC—的克隆摇菌提取质粒进行KpnI／HindIll双酶切鉴AAGCTTATTAGTTACCCTTTAATGTGGCGGC—定，结果表明重组质粒经Kpn工／HindIII双酶切出与A3(下划线为酶切位点，粗斜体为肠激酶酶切位点)预期大小一致的条带(图3)，验证的质粒经DNA测

8、序PCR扩增出目的基因。将获得的PCR