nk4基因重组原核表达载体的构建及在大肠杆菌中表达

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1、温州医学院硕士学位论文NK4基因重组原核表达载体的构建及在大肠杆菌的表达中文摘要目的构建Nl“基因的原核表达载体pET-26b(+)-NK4，转化E．ColiRosseta(DE3)并表达。优化Nl“蛋白的表达条件制备重组蛋白并通过体外试验观察其活性，为规模化生产NK4蛋白作基础。方法1．NK4基因重组克隆载体的构建与鉴定以载体pVITR02．mcs-NK4为模板扩增NK4基因片段，1％低熔点琼脂糖凝胶电泳分离特异性产物，DNA胶回收试剂盒回收、纯化NK4基因eDNA并测定浓度。将NK4基因eDNA与载体pMDl9一TSimple连接构建重组克隆载体pMDl9一TSimpl

2、e-NK4，转化E．ColiDH5a，行氨苄青霉素和0【．筛选。采用菌落PCR、NdeI和SalI双酶切和序列分析等方法，验证目的基因的存在和序列正确性。2．重组原核表达载体pET-26b(+)．NK4的构建与鉴定转化重组克隆载体pMDl9．TSimple-NK4的E．ColiDH5a行增菌，提取重组载体行NdeI和SalI双酶切。酶切产物经1％低熔点琼脂糖凝胶电泳分离纯化，插入经相同双酶切的载体pET-26b(+)。连接产物以冷CaCl2法转化E．ColiRosseta(DE3)并行卡那霉素(50l上g／mL)和氯霉素(34Itg／mL)筛选，阳性重组菌命名为Rosset

3、a(DE3)／pET-26b(+)-NK4。重组表达载体用菌落PCR、NdeI和SalI双酶切等方法验证目的片段的存在。3．重组蛋白表达条件的优化1)诱导时间的优化：重组菌Rosseta(DE3)／pET．26b(+)-NK4接种于LB液体培养基(含50pg／mL卡那霉素、34I-tg／mL的氯霉素)，37*(2过夜，取1IIll菌液以1：50行扩大培养，至OD260为0．6时加入终浓度为0．5mmol／L的IPTG，诱导表达5h。每1h取样1次，每次80pl，加入20pl5×上样缓冲液，混匀后煮沸5min，12000r／min，3min，行SDS．PAGE分析。2)IPT

4、G浓度的优化：同上增菌后的重组菌Rosseta(DE3)／pET-26b(+)-NK4培养物分别加入终浓度为O．1mmol／L、O．25mmol／L、O．5mmol／L、0．75mmol／L、1．0mmol／L的IPTG，37℃，230r／min，诱导3h后取样同上处理行SDS．PAGE电泳分析。温州医学院硕士学位论文3)诱导温度的优化：将同上增菌后的重组菌Rosseta(DE3)／pET．26b(+)-NK4培养物加入终浓度为O．5mmol／L的IPTG，分别在16"C、25℃、30。C、37。C，230r／min，诱导3h后取样同上处理行SDS—PAGE电泳分析。4．W

5、esternblot分析重组菌Rosseta(DE3)／pET-26b(+)-NK4经IPTG诱导后，超声裂解收集包涵体并洗涤。取洗涤后的包涵体经SDS．PAGE电泳，转膜，加1：500稀释的兔抗人HGF多克隆抗体，4"C过夜。洗膜后加1：1000稀释的HRP标记的羊抗兔IgG单抗，室温振荡lh。洗膜后采用DAB试剂盒显色。5．重组蛋白的纯化包涵体的洗涤：称量菌体湿重，以1g菌：20mLpH8．O细菌裂解液混匀后超声裂解(400W，10S，间隔20S，300次)，4"C、12000r／min、10min，弃上清，沉淀按序用pH8．0包涵体洗涤液A，B液和C液，各3次。6mo

6、l／L盐酸胍溶解包涵体，测定蛋白浓度。Ni-NTA树脂亲和层析法纯化NK4蛋白：以1mLNi-NTA树脂：10mg蛋白挂柱，5倍NTA体积的无咪唑缓冲液平衡(流速30mL／h)，再用20mmol／L"-一200mmol／L咪唑缓冲液连续洗脱(流速15mL／h)。收集吸收峰值的洗脱液，行SDS．PAGE分析，同时以含其他浓度咪唑的吸收峰值洗脱液作为对照。6．重组蛋白的复性将纯化的重组蛋白用pH8．0复性液进行稀释复性。复性后按序用透析液I、II、III进行透析，各3次，每6h换液1次。以牛血清白蛋白为标准制备标准曲线，采用考马斯亮蓝法测定复性蛋白浓度，真空冷冻干燥后．70"C

7、保存。7．重组蛋白体外活性测定重组蛋白作用于Hela细胞，观察其对后者的贴壁、迁徙和凋亡等的影响。在Hela细胞培养物中加入重组蛋白(7lxg／mL)，常规培养，观察重组蛋白对细胞贴壁(培养1．5h)和凋亡(培养24h)的影响，以加入等量PBS的Hela细胞组作为对照。无菌盖玻片平放于6孔板中部，加入Hela细胞，常规培养，待其贴壁后将盖玻片取出，培养板底部出现边界整齐的无细胞空白区。加入重组蛋白(7lxg／mL)，常规培养24h后观察重组蛋白对Hela细胞迁徙的影响，以加入等量PBS的Hela细胞组作为对照。结果