miR-145对HepG2细胞中肿瘤干细胞增殖的影响-论文.pdf

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1、62·实验研究·Movember2013，Vo1．11，No．31圆miR-145对HepG2~1]]胞中肿瘤干细胞增殖的影响何涛李国庆谢娟陈宏辉陈汶(1南华大学附属第二医院消化科，湖南衡阳421001；2南华大学医学院诊断学教研室，湖南衡阳421001)【摘要】目的探讨HepG2细胞中miR一145与肝癌干细胞之问的关系及可能的分子机制，为肝癌诊治探索一条新方法。方法分别以siRNA—NC—FAM和shRNA—GFP为转柒物，倒置荧光显微镜下观察用脂质体Lipofectamine2000转染的效率，进行转染效率评价

2、。结果中剂量的siRNAoligo转染HepG2细胞效果较好；各实验对照组相比，miR一145—5p模拟物转染组的miR一145表达明显上调；过表达miR一145抑制HepG2细胞生长；转染后48h模拟物转染组过表达的miR一145可明显降低OCT4蛋白水平及干细胞标志物CD90mRNA的表达。结论以Lipofectamin2000为转染试剂，使用中剂量的siRNAoligo转染HepG2细胞效果优于低、高剂量，同时明显优于转染shRNA者；过表达miR一145可抑制HepG2细胞株增殖；miR一145可能通过下调O

3、CT4基因表达抑制HepG2细胞株中肿瘤干细胞的增殖，是一种潜在的肝癌“保护性”miRNA。【关键词】miR一145；肝癌；Oct4基因；干细胞中图分类号：R735．7文献标识码：B文章编号：1671-8194(2013)31-0062—02MicroRNAs(miRNAs)是生物进化上高度保守的一类非编码小①实验分组：1、hsa—miR一145mimics组2、Blank组3、Mock组4、RNA，研究表明其参与细胞活动的各方面，包括分化、生长、代谢、NC组。②引物设计：参考GenBank~因序列进行引物设计，并证

4、实设增殖、凋亡、肿瘤生成等J。miRNA主要参与基因的转录后调控，计碱基序列与目的基因相符。③逆转录反应体系(表1)。通过与靶基因的mRNA完全或者不完全的互补配对而起到促进目标表1逆转录反应体系表mRNA降解或者抑制蛋白翻译的作用】。研究显示miRNA与肝癌的转移、复发及预后关系密切。胡臻等研究证实miR-145在肝癌HepG2细胞系中的表达水平低于正常肝组织。张帅等_6研究发现miR．145通过下调Oct4的表达从而抑制肺腺癌A549细胞株中干细胞的增殖。我们拟通过导入miRNA145模拟物，增加细胞内miRNA

5、145表达，进一步研究其对肿瘤干细胞增殖的影响。Oct4是参与调控胚胎干细胞自我更新，1-3统计学处理并且维持其全能性，最为重要的转录因子之一，主要表达于胚胎干细本实验结果使用SPSSl3．0统计学软件进行数据分析，实验结果胞、生殖干细胞以及未分化胚胎癌组织中，它的剂量依赖性表达与决采用均数±标准差(±S)表示，单因素方差分析比较各组间差定细胞的分化程度息息相关】。Kosik等发现在胚胎干细胞@miR-145异，并用LSD检验法进行组间两两多重比较。显著性检验水准取0【=可以靶向抑制Oct4蛋白表达，而对Oct4mR

6、NA表达没有影响。而且发0．05，确定P

7、A，细胞状态均尚可，在中高miR-145是否通过下调OCT4基因表达抑制HepG2细胞株中肿瘤干细胞剂量时，转染效率较低剂量好，在80％左右；转染shRNA，细胞状态的增殖，为临床寻找治疗肝癌的新靶点提供基础。相对稍差一点，转染效率最高不~1J40％。故用中剂量的siRNAoligo转1资料与方法染HEPG2细胞效果较好。1．1体外细胞培养2．2实时荧光定量PCR检测转染效果使用DMEM培养基培养HepG2细胞。传代时使用2．5g／L的胰蛋白使用实时荧光定量PCR的方法检N~miR一145—5P在各组中的表达水酶进行

8、细胞的消化。用吹打管制备单细胞悬液，使用计数板计数，调平。电泳结果显示PCR产物大小正确，无杂带说明无非特异性扩增；整适当的浓度用于后续实验。转染后24h及48h转染模拟物组中的miR-145—5pmRNA表达水平均较各1．2RealTimePCR检测对照组显著升高，有统计学意义(P0．0