小鼠胚胎成纤维细胞的分离和培养.doc

《小鼠胚胎成纤维细胞的分离和培养.doc》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、小鼠胚胎成纤维细胞的分离和培养一、实验材料1.主要仪器设备(1)倒置显微镜（Olympus，Japan）(2)CO2培养箱（BB16HF，上海力申科学仪器有限公司）(3)100ml的玻璃培养瓶（江苏海门市大路塑料实验仪器厂）(4)6孔培养板（COSTAR，每孔直径为3.5cm）(5)Eppendroff管(6)1ml,2ml,5ml的玻璃滴管各30支；10ml尖底离心管和直径为8cm的平皿(7)离心机(8)5ml冻存管(9)两套小鼠用解剖器械（包括眼科剪和眼科镊）2.主要试剂配制(1)MEF(mouseembryofibroblast，小鼠

2、胚胎成纤维细胞)培养液——低糖DMEM母液1)用一个1000ml的大烧杯加入1000ml无菌无内毒素的超纯水（购自福州新北生化工业有限公司）；2)将一小袋低糖DMEM(GIBCO/BRL,Cat.No.31600-034)全部加入上述水中，同时轻轻搅拌，并冲洗包装袋的内面以洗下所有的粉未。3)每升培养基中添加3.7gNaHCO3。4)搅拌直至完全溶解。5)用1NHCl或1NNaOH调培养基的pH至比最终的工作液的PH低0.2-0.3，调好PH后，将容器密封（在该实验中用1NHCl调PH至7.3）。6)立即用0.22um的滤器过滤除菌，装入高

3、压过的盐水瓶中,4℃保存(1个月内用完)。——MEF培养液取100ml上述配好的低糖DMEM液体，加入10000IU青霉素钠（6.25mg）和10mg链霉素，溶解后再次调节PH至7.3，经0.22um的滤器过滤至高压过的血清瓶中，再添加10ml分装好的新生牛血清（NewbornCalfSerum,GIBCO/BRL,需56℃，30min灭活过），4℃保存至使用。(2)PBS在500ml超纯水中依次溶入NaCl4.0gKCl0.1gNa2HPO4.12HO21.445gKH2PO40.1g于121℃高压灭菌30min或经0.22um的滤器过滤

4、除菌再分装入100ml洁净灭菌的盐水瓶中，再放入4℃冰箱中保存备用。(3)0.25%胰蛋白酶—0.02%EDTA混合消化液在100ml超纯水中分别溶解胰蛋白酶干粉(Trypsin,Sigma,T4799)0.25gEDTA0.02g·4·NaCl0.7gNa2HPO4.12HO20.024gKH2PO40.024gKCl0.037gTris0.3gD-葡萄糖0.1g酚红1mg于4℃过夜，使之充分溶解，用1mol/lHCl调PH至7.6,0.22um的滤器过滤除菌，在–10～30℃下冻存备用。(1)0.1%的明胶水溶液称明胶0.1g（Sigm

5、a,G—9391）溶于100ml超纯水中，先加热溶解，再分装入20ml的血清瓶中于121℃高压灭菌45min，于4℃保存。(2)10ug/ml的丝裂霉素C工作液1)0.5mg/ml的丝裂霉素C母液在盛有2mg丝裂霉素C的小瓶中加入4ml高压灭菌的PBS，用高压灭菌的尖嘴混匀。即得0.5mg/ml的丝裂霉素C母液。注：此步应在胶卷暗盒内操作，然后于4℃避光保存。2)10ug/ml的丝裂霉素C工作液在24.5ml的MEF培养液中加入0.5ml的0.5mg/ml的丝裂霉素C母液，并经0.22um的滤器过滤至25ml血清瓶中。用前临时配制，并在37

6、℃的CO2培养箱中预温30min.。(3)冻存液取2支1.5mlEppendroff管，每管均加入0.9mlDMEM（低糖型）培养液和0.1ml二甲基亚砜（DMSO，AR纯，中国医药集团上海化学试剂公司），置40C冰箱中预冷60min。1.动物：性成熟期即大于8周龄昆明种小白鼠，领自福建医科大学实验动物中心。二、实验步骤1.获取小鼠胚胎(1)将8周龄的昆白♀鼠和12周龄的昆白♂按1:1比例合笼。(2)次日晨10:00前观察♀鼠阴道口，有乳白色或蛋黄色胶冻状物（阴道栓）即定为怀孕0.5天。(3)实验时断颈处死孕13.5天的母鼠，置于蜡盘上。(

7、4)75％酒精消毒后，用普通剪刀和镊子剪开下腹皮肤，并用两把弯头止血钳夹住切口处的皮肤向头尾两侧牵拉即剥皮。(5)用眼科弯镊和眼科弯剪打开腹腔，暴露出子宫。(6)用眼科弯镊夹住一侧子宫，分离子宫系膜，眼科弯剪剪断子宫角和子宫颈，将整个子宫分离下来（注意勿使子宫滑落到腹腔外，避免污染）。(7)将子宫置于无菌滤纸上去除血迹。(8)在超净台内将子宫移入预先盛有PBS的平皿中，洗涤数次。(9)将子宫移入另一盛有PBS的平皿中，用眼科弯剪沿子宫系膜打开子宫，取出带有胎膜的胎鼠，并用两把眼科镊子剔除胎膜，取出胎鼠（一般有12只）。(10)将胎鼠移入另一

8、盛有PBS的平皿中，用眼科剪和眼科镊去除胎鼠的头、四肢和内脏，得鼠胚躯干。(11)将鼠胚躯干移至另一盛有PBS的平皿中，用PBS洗涤两次至无肉眼可见的血色。·4·1.小鼠胚胎成纤