小鼠胚胎成纤维细胞MEF培养相关知识总结

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1、小鼠胚胎成纤维细胞MEF培养相关知识总结2009-08-1918:39:07来源:未知【大中小】评论:条-摘要：小鼠胚胎成纤维细胞的富集1、给13-14天的孕鼠注射大约0.5ml阿佛小鼠胚胎成纤维细胞的富集1、给13-14天的孕鼠注射大约0.5ml阿佛丁。当鼠麻醉后，实施断颈法处死小鼠。2、用70％乙醇擦拭腹部，把皮肤向后拉，暴露出腹膜。用消毒过的工具，剪开腹壁以暴露出子宫角。将子宫角移到10cm的皿里。用10ml不含钙镁离子的PBS洗三遍。3、用剪刀剪开每一测的胚囊,并将胚胎移到培养皿中。4、用两副钟表镊子将胎盘和膜与胚胎分离开，分离后切除内脏（所有深色的东西）。将胚胎转移到(有

2、盖)培养皿中，用10ml不含钙镁离子的PBS洗三遍。5、用带有弯钩的眼科剪将组织剪碎，当你剪的很累以致于不能再剪的时候，加入2ml胰蛋白酶/EDTA继续剪。再加入另外5ml胰蛋白酶/EDTA，并在37℃孵育大约20分钟。此时，返回至第一步，对下一只鼠进行操作。6、执行1－4步，到将胚胎置于胰蛋白酶/EDTA中这一步。7、吹打胰蛋白酶/EDTA中的胚胎，直到有很少的组织物残留。将皿放回培养箱再孵育10分钟。8、用20ml培养基以终止胰蛋白酶/EDTA的消化，将皿中的物质转移至50ml锥形管中。9、混匀管内的物质，加入到含有20ml培养基的T75培养瓶中。每个培养瓶中装大约3个胚胎。1

3、0、将这些培养瓶放在培养箱中37℃培养过夜。11、将胚胎置于PBS中，并重复第5步。12、第二天更换培养基，以去除碎片和中毒的细胞及其分泌的物质。13、当培养瓶中的细胞长到80-90%汇合时并仍处于指数生长期时，是冻存细胞的最佳时期。一般说来，这发生在准备胚胎的第二天。这可能或早或晚发生，所以请注意观察你的培养瓶。注释：我们已用CF－1品系的鼠制备了成纤维细胞。培养基成分：88％DMEM10％FBS1％ NEAA1%  双抗对于新建立的细胞系，要对样本进行支原体检测。小鼠胚胎成纤维细胞的消化/传代1、移去MEF培养基2、用5ml不含钙镁离子的PBS洗涤细胞（以去除胰蛋白酶的抑制物）

4、。3、每个培养瓶里加入1.5ml的胰蛋白酶/EDTA（0.05%的胰蛋白酶），消化5min。4、为了使细胞分散开，轻轻吹打细胞。5、每加入1ml的胰蛋白酶/EDTA，加入至少1ml的MEF培养基以终止胰蛋白酶的消化。6、将细胞悬液加入到15ml的锥形管中，吹打几次，使细胞分散为单个的。7、在新的T75培养瓶中加入10mlMEF培养基。8、将细胞悬液分装到新的T75培养瓶中，放在37℃培养箱中进行培养。注释：MEF培养基成分：89%DMEM(Gibco#12100-046)10%FBS(Gibco#16000-044)1% NEAA(Gibco#11140-050)MEF每传一代就会

5、生长得更慢些。你第一次传代的比例可以是1:5，但是最后一次的传代（第4代或第5代）比例应该是1:2。小鼠胚胎成纤维细胞的冻存重悬培养基：80%DMEM20%FBS1% NEAA冻存培养基：60％DMEM30％FBS20％DMSO1、用不含钙镁离子的PBS洗一次细胞。2、加入胰蛋白酶/EDTA37℃消化大约5min。3、将细胞吹打下来。4、加入与胰蛋白酶/EDTA等体积的培养基以终止胰蛋白酶的消化。5、吹散大块组织。如果还有大块组织存在，可将悬液加入到50ml的管中使其沉淀。6、取上清液，将其分装到锥形管中，1000rpm离心5min。7、每个冻存瓶中加入0.5ml（冻存液的一半体积

6、）的重悬培养基重悬细胞。8、逐滴加入等体积的（0.5ml/瓶）冻存培养基，混匀。现在DMSO的浓度是10％。9、每个冻存瓶中加入1ml的细胞。10、迅速将细胞转移到冻存的容器中，-70℃冻存过夜。（细胞不能长时间放置在室温而含有DMSO的情况下）11、第二天将细胞放于液氮中长期保存。注释：提前标注好冻存细胞的以下信息：细胞系名称传代的代数冻存细胞的数目日期Initials注明冻存/解冻形式小鼠胚胎成纤维细胞的解冻/复苏1、将冻存瓶从液氮中取出。2、放在37℃水浴中快速解冻，beingcarefulnottoimmersethevialabovethelevelofthecap.3、

7、当仅还有一点冰晶残留时，用95％的乙醇消毒冻存瓶的外面，并将其置于hood中。（为什么用95％的乙醇消毒？hood是什么？）4、轻轻地上下翻转细胞一次，将它们放入15ml锥形管中。5、想管中逐滴加入10ml培养基。这一步操作不能少于两分钟。做快了对细胞将是一种打击，你将得到比其他方法具有更低生活能力的细胞。6、1000rpm离心5min。7、将细胞重悬于10ml培养基中，然后放入T75培养瓶中。8、放入37℃培养箱。9、注明冻存/解冻的形式，以更新数据。网友观点是：1