1型鸭疫里默氏杆菌比较蛋白质组学研究及抗体检测方法的建立

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1、华中农业大学硕士学位论文1型鸭疫里默氏杆菌比较蛋白质组学研究及抗体检测方法的建立姓名：杨依霏申请学位级别：硕士专业：基础兽医学指导教师：程国富；邵华斌2012061型鸭疫里默氏杆菌比较蛋白质组学研究及抗体检测方法的建立摘要鸭疫里默氏杆菌(Riemerellaanatipestifer，RA)是一种革兰氏阴性菌，火鸡、水禽等对其敏感。它是鸭疫里默氏杆菌病的病原体，主要引起宿主的纤维素性气囊炎、脑膜炎、心包炎、肝周炎、以及干酪性输卵管炎，并伴有不同程度的败血症，对养殖业的发展存在着巨大的威胁。因此，开发鸭疫里默氏杆菌病的疫苗对防止该疫病的发生有重大意义。同时，建立一种诊断鸭疫里默氏

2、杆菌抗体的方法也对临床实践中监测免疫效果、诊断疾病具有指导意义。本试验中对限铁环境中的RA以及正常培养环境中的RA的分泌蛋白进行差异比较，发现其差异表达的蛋白，并对差异蛋白的免疫原性进行鉴定。此外，利用重组ompA蛋白作为包被抗原，建立了检测RA抗体的间接ELISA方法，主要完成以下研究工作：通过模拟动物机体内的限铁环境，在限铁环境中培养RA。通过比较蛋白质组学，利用双向电泳技术和质谱鉴定技术，鉴定出在限铁环境中有23个蛋白质点表达量上升，选取其中的12个蛋白质点进行质谱鉴定，分别代表了8类蛋白质，包括IⅡ型纤维连接蛋白、分泌蛋白家族蛋白、磷酸甘油酸酯激酶、亮氨酸富集蛋白质、2

3、类RA假想蛋白、似半乳糖结合区域蛋白、延伸因子。选取理论等电点、分子量和实际等电点、分子量相近的蛋白质Fel0和Fel9(hypotheticalproteinRiean1750和hypotheticalproteinRiean1752)进行原核表达。构建了重组质粒pET-28a(+)一Fel0和pET-28a(+)．Fel9，并通过蛋白质诱导表达技术，表达出Fel0和Fel9蛋白。经过镍亲和层析纯化，获得了较高纯度的RA的Fel0和Fel9两种蛋白。通过Western-blotting分析，表明蛋白质Fel0和Fel9与RA的阳性血清是有反应性的。通过鸭的免疫攻毒试验，证明蛋

4、白质Fel0和Fel9对鸭具有一定的免疫保护性。且两种蛋白同时配合免疫，比单独一种蛋白作为免疫原具有更好的免疫保护力。此外，成功构建了重组质粒pET-28a(+)．ompA，经过诱导表达后，表达出RA的ompA蛋白。经过纯化的重组ompA蛋白作为包被物，以方阵滴定法确定抗原包被浓度为1．5ug／mL，待检血清稀释度为1：100。与普通的微量凝集试验相比，该方法灵敏度较高，比凝集试验高16-128倍。与鸭源大肠杆菌、多杀巴氏杆菌、链球菌、呼肠孤病毒、鸭肝炎病毒和鸭瘟病毒感染鸭血清均无交叉反应，表明该方法特异性强。ompA蛋白作为抗原包被到酶标板之后于．20℃保存时间为3个月。经过

5、重复性试验证实，该方法批内重复的变异系数小于5％(1．8％4．6％)，批间重复变异系数小于9％(1．2％．8．8％)。结果表明，本试验建立的间接ELISA检测方法具有良好的重复性和稳定性。华111农业大学2012届硕士研究生学位论文利用该方法进行雏鸭免疫RA灭活油乳剂疫苗之后血清抗体水平变化规律的研究。试验结果表明，在雏鸭免疫RA疫苗之后7d鸭血清中的抗体水平开始有上升趋势，在35d达到高峰，之后出现下降趋势，在77d左右抗体水平与14d的抗体水平相近。关键词：鸭疫里默氏杆菌；比较蛋白质组学；限铁培养；ompA；间接ELISAIl1型鸭疫里默氏杆菌比较蛋白质组学研究及抗体检测方

6、法的建立ABSTRACTRiemerellaanatipestiferisagram-negativebacterium,whichissensitivetowaterbirdsandturkey．ItisthepathogenofRiemerellaanatipestiferdisease．Thediseaseischaracterizedbyfibrinouspericarditis，per[hepatitis，andairsacculitis．Itwasathreatentotheaquacultureindustry．Sotheresearchinvaccineisve

7、ryimportant．AndestablishingamethodfordetectingantibodyofRiemerellaanatipestiferisofguidingsignificance．Inthisresearch，thesecretedproteinsofRiemerellaanatipestiferwhichwasculturedbothinironrestrictionenvironmentandnormalenvironmentwerecomparedtoiden