沙门菌外膜蛋白D的原核表达及多克隆抗体制备.pdf

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1、生物技术通讯⋯⋯一-一，LETTERSINBIOTECHNOLOGYVol．·21No．·4Jut．‘，．2010497doi：10．3969／j．issn．1009—0002．2010．04．O11研究报告沙门茵外膜蛋白D的原核表达及多克隆抗体制备郭晓雅，师长宏，邵成，赵勇，史皆然第四军医大学a．西京医院呼吸内科；b．实验动物中心；陕西西安710032[摘要]目的：在大肠杆菌中表达沙门菌外膜蛋白(OMP)D，纯化后制备兔抗OMPD抗体。方法：用PCR方法从鼠伤寒沙门菌中扩增出ompD基因，并插入融合表达载体pET一28a(+)的多克隆位点，构建重组表达质粒pET28a(+)一o

2、mpD；以重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，筛选阳性重组菌株，经IG诱导目的蛋白表达，在变性条件下对目的蛋白进行亲和层析纯化；以表达的0MPD蛋白免疫家兔，制备抗OMPD的多克隆抗体并进行鉴定。结果：扩增了ompD基因，测序证实正确后亚克隆于表达载体pET一28a(+)中，经PCR筛选和酶切鉴定获得阳性克隆，经诱导在大肠杆菌中表达出相对分子质量为40xlO。的目的蛋白并进行纯化；纯化的OMPD免疫家兔后，能有效地刺激特异性抗体的产生，抗血清的效价达到1：10000以上，且具有良好的特异性。结论：构建ompD基因的原核表达载体，并在大肠杆菌中获得高效表达；制备出兔抗OMPD抗

3、体，效价及特异性均良好，为进一步制备肠黏膜高亲和力疫苗奠定了基础。[关键词]外膜蛋白D；沙门菌；原核表达；多克隆抗体[中图分类号]Q78；R392．1[文献标识码]A[文章编号]1009—0002(2010)O4—0497—04ProkaryoticExpressionofSalmonellaOuterMembraneProteinDandDevelopmentofitsPolyclonalAntibodyGUOXiao—Y，SHIChang-Hong~,SHA0Cheng~,ZHA0Yon，SHIe—Ranaa．RespiratoryMedicineDepartmentofXi

4、jingHospital；b．LaboratoryAnimalCenter；FourthMilitaryMedicalUniversity，Xi"an710032，China[Abstract]Objective：ToobtainSalmonellaoutermembraneprotein(OMP)DexpressedinE．coliBL21(DE3)forproducingitspolyclonalantibody．Methods：TheompDgeneamplifiedfromS．typhimuriumbyPCRwasinsertedintoexpressionplasmid

5、pET-28a(+)toconstructrecombinantplasmidpET一28a(+)一ompD．Therecombinantplas—midwastransformedintoE．coliBL21(DE3)fortheexpressionOMPDunderIPTGinduction．TheproteinOMPDwaspurifiedwithNi+-NTAsystemandusedtoimmunizerabbitstoprepareanti—OMPDantibody，andtheanti—body'spropertieswereidentified．Results：T

6、heSalmonellaompDgenewasconfirmedbyDNAsequencing，andpositiverecombinantcloneswereidentifiedbyrestrictionenzymedigestionanalysisandDNAsequencing．Afterin—ductionwithIPTG，OMPDwithMrbeing40kDawasexpressedinE．coliBI21(DE3)andwaspurified．Rabbitpolyclonalantibodywithagoodspecificitywasobtained，andthe

7、titerwasaboveof1：10000．Conclusion：TherecombinantexpressionplasmidofOMPDwasconstructedsuccessfullyandexpressedinE．coli．Thepreparedrab—bitanti—OMPDantibodyhadahightiterandspecificity，whichlaidafoundationforthepreparationofintestinalmucosaimmuno