福氏志贺菌2型外膜蛋白A的原核表达及多克隆抗体的制备.pdf

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1、动物医学进展。2015，36(5)：6-10ProgressinVeterinaryMedicine福氏志贺菌2型外膜蛋白A的原核表达及多克隆抗体的制备刘祥(陕西理工学院生物科学与工程学院，陕西汉中723001)摘要：福氏志贺茵外膜蛋白A是细菌入侵宿主细胞的作用蛋白，同时激活机体的免疫机制对抗细菌的感染，在动物疫苗上有很好的应用前景。采用分子克隆方法获得福氏志贺茵Omlc·A蛋白表达菌株；利用SDS_PAGE电泳切胶纯化、尿素梯度复性获得OmpA蛋白，免疫小鼠制备OmpA蛋白多克隆抗体；采用ELIS

2、A法检测抗体滴度，Westernblot检测抗血清特异性；DNAMan与MEGA软件分析OmpA蛋白系统进化关系。结果显示，OmpA重组载体双酶切、DNA测序鉴定结果，以及蛋白表达、纯化条带大小与预测一致；ELISA法确认OmpA抗血清滴度达1：1600，Westernblot证实抗血清具有很好的特异性。OmpA序列系统发生分析发现不同种的致病菌存在同源性，尤其D端同源性较高，并且不同种志贺菌具有更高的同源性。表明成功制备OmpA蛋白和小鼠多克隆抗体，为OmpA蛋白功能与疫苗开发研究奠定了基础。关键

3、词：福氏志贺菌；OmpA蛋白；多克隆抗体；酶联免疫吸附试验；Westernblot中图分类号：$852．61文献标识码：A文章编号：1007—5038(2015)05—0006—05福氏志贺菌(Shigellaflexneri)为革兰阴性致2a，E．coliDH5a，E．coliBL21菌株，pET一32a质粒病菌，属于高度传染性和危害严重的急性肠道传染本实验室保存；昆明鼠购于西安交通大学实验动物病，临床上可引起细菌性痢疾，病死率高口；世界各中心。地都有流行，尤其是发展中国家，患病群体主要为儿1．1

4、．2主要试剂限制性内切酶，Taq酶，T4一童_3]。随着抗生素的滥用，福氏志贺菌产生不同程DNA连接酶，核酸标准，蛋白标准均购自宝生物工度的耐药性[4]，有待开发一种新型的安全、无耐药性程(大连)技术服务公司；质粒提取试剂盒、胶回收试的亚单位疫苗。外膜蛋白A(outermembranepro—剂盒购自上海生物工程公司；引物由西安沃尔森生teinA，OmpA)为革兰阴性菌主要外膜蛋白之物技术有限公司合成；基因测序为北京奥科鼎盛生一[5]物科技有限公司；IPTG、二抗为Sigma公司产品。，可促进福氏志

5、贺菌与宿主菌的黏附与侵袭嘲，1．2方法是福氏志贺菌主要毒力蛋白。此外，研究发现将1．2．1OmpA重组质粒的构建依据NCBI公布OmpA免疫小鼠可激活机体的细胞免疫和体液免疫的福氏志贺菌2a菌株OmpA基因序列。设计引水平_7]，并产生很小的炎症反应，对福氏志贺菌的感物：正向引物：5r_ACAGGATCCATGAAAAAGA—染有很强的免疫保护作用[7]。有望作为一种新型CAGCTAT一3；逆向引物：5-GCTAAGCTTTTA—的亚单位蛋白疫苗]。AGCCTGCGGCTGAGT-3，下划线为Bam

6、HI和本研究利用分子克隆方法获得福氏志贺菌Om—HindⅢ限制性内切酶位点。PCR采用5OL反应pA蛋白表达菌株；纯化OmpA蛋白，免疫小鼠，制体系：缓冲液5L，基因组模板3L，10mmol／L备小鼠OmpA抗血清；为OmpA蛋白介导福氏志贺dNTP2L，25t~mol／L引物各1L，Taq酶0．5菌侵染宿主的靶向蛋白研究，以及OmpA免疫保护L，补水至50L。PCR反应条件为：94℃3min；功能及疫苗的开发研究奠定基础。94℃30S，55℃45S，72℃90S，30个循环；最后1材料与方法72℃

7、延伸10rain，16。C终止反应。采用8g／L琼脂1．1材料糖凝胶电泳检测PCR片段大小。将PCR产物与1．1．1菌株、质粒与实验动物ShigellaflexneripET-32a质粒载体双酶切后，利用T4-连接酶连接，收稿日期：2014—11-14基金项目：陕西省教育厅科学研究计划(2O13JKO723)；陕西理工学院校级项目(sLGQD13—15)作者简介：刘祥(1983一)，男，陕西汉中人，讲师，博士，主要从事蛋白质组学与免疫学研完。动物医学进展2015年第36卷第5期(总第263期)sio

8、nformationandinter-cellularspreading[J]．PLoSOne，r9]PoreD，ChowdhuryP，MahataN，eta1．Purificationandcharacterizationofanimmunogenicoutermembraneproteinof2012，7(11)：e49625．PoreD．MahataN，PalA，eta1．OutermembraneproteinAShigellaflexneri2a口]．Vac