酚、氯仿、异戊醇法沉淀DNA.doc

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1、酚：氯仿：异戊醇法抽提基因组DNA1.从无水乙醇中取出少许肌肉或者性腺组织（约50mg），剪碎，加入干净灭菌的EP管中；2.准备适量的裂解缓冲液SNET（600μL），随即在SNET中加入蛋白酶K使终浓度为400μg/ml,向组织中裂解缓冲液。SNET：20mmol/Ltris-Cl(Ph8.0)5mmol/LEDTA(Ph8.0)400mmol/LNaCl1%(m/V)SDS上述溶液需经过0.45μm的硝酸纤维素滤器过滤除菌，保存于室温。3.管子垂直放置于震荡平台或振动恒温箱中55℃放置过夜（消化过程中样品的充分混合时非常必要的。过夜消化后，应当看不到组织，缓冲液呈现灰

2、色状态）.4.加入等体积(600μL)的酚：氯仿：异戊醇，密闭管口，室温下置于震荡平台30min.(不同的实验阶段，需要不同的振动速度.)备注：酚取下层（上层为保护液）过会变成淡黄色为佳，酚：氯仿：异戊醇混合后澄清才可以用5.离心吸取上清（4℃11,000rpm（11200×g）最大转速简短离心25分钟（5min钟就好），转移上清至另一新的离心管中）。6.取出消化液，加入600μL（等体积）酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）混合液（按一个样品1.5ml配置），温和混匀20min，11,000rpm（11200×g）离心15min，回收上清；5min7.重复酚/氯仿/异戊醇

3、抽提过程2次后，然后换成每管600uL氯仿抽提。8.回收的上清液加入1/10体积的3mol/LNaAc和等体积异丙醇，温和混匀后-20℃静置2h9.4℃13000转/分离心20min，弃上清；5min10.用75％乙醇洗涤1-2次（1000ul，11000转/分离心2min），弃上清；轻柔晃匀11.冰冻无水乙醇洗涤1-2次（1000ul，11000转/分离心4min）弃上清，自然晾干或烘干，DDW或TE溶解，30-50ul，再加入1ul10mg/ml的RNA酶溶液，37℃温育2h，核酸蛋白定量仪检测OD及浓度。12.DNA质量检测用脉冲场电泳检测抽提DNA质量，也可以用一

4、块20cm长1%琼脂糖凝胶30-35V/cm过夜电泳。