牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的表达及多克隆抗体制备.pdf

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1、动物医学进展。2(／13，34(9)：128—132ProgressinVeterinaryMedicine牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的表达及多克隆抗体制备杨有武，杨有德(1．占海省海北州海晏县兽医站，青海海晏812200；2．青海大学畜牧兽医科学院，青海西宁810001)摘要：为高效表达牛病毒性腹泻病毒E2蛋白并制备多克隆抗体，参考牛病毒性腹泻病毒(BVDV)基因组序列设计一对引物，利用RT—PCR扩增出822bp的E2基因片段，经测序鉴定正确后，将其定向克隆至原核表达载体pET32a(+)中，鉴定正确后，在大肠埃希菌BI21(DE3)细胞内得到了以包涵体表达形式存在的重组融合蛋白，

2、重组蛋白亲和层析纯化后，免疫印迹鉴定表明重组蛋白能够被牛病毒性腹泻病毒阳性血清特异性识别，具有良好的反应活性。将纯化的重组蛋白免疫新西兰白兔制备多克隆抗体，间接EIISA测定其抗体效价达1：25600。本研究所表达的E2蛋白及制备的多克隆抗体，为E2蛋白结构、功能的研究以及抗原表位的鉴定奠定了基础，为进一步开发牛病毒性腹泻病毒快速检测试剂提供了条件。关键词：牛病毒性腹泻病毒；E2蛋白；表达；多克隆抗体中图分类号：$852．659．6；Q789文献标识码：B文章编号：1007—5038(2Ol3)09—0128O5牛病毒性腹泻(Bovineviraldiarrhea，BVD)是由牛病毒

3、性腹泻病毒(Bovineviraldiarrheavirus，1材料与方法BVDV)引起的以牛腹泻、发热、咳嗽、黏膜糜烂溃疡1．1材料以及母畜流产为主要特征的一种接触性动物传染1．1．1茵毒株、载体、血清克隆菌株DH5a感受病㈠。一旦感染。可造成持续感染，持续感染牛处态细胞、表达菌株BI21(DE3)感受态细胞、表达载于免疫耐受状态时，临床不表现任何症状，但仍然带体pET32a(+)由青海大学畜牧兽医科学院动物疫毒、排毒，可严重损坏机体的免疫机能，引起牛的生病诊断防治实验室制备并保存；牛病毒性腹泻病毒产性能下降，还可以诱发其他病原体的感染而导致毒株由青海大学畜牧兽医科学院动物疫病诊断

4、防治继发感染或混合感染等，给养牛业造成了巨大的经实验室分离鉴定并保存；pMD18-T克隆载体购自济损失，是危害养牛业的主要疫病之一[3]。BVDV宝生物工程(大连)有限公司；牛病毒性腹泻病毒阳属于黄病毒科(Flaviviridae)瘟病毒属(Pestivir性血清与阴性血清购自中国兽医药品监察所。us)，为正链、单股RNA病毒，基因组只含有一个开1．1．2所用试剂Trizol、鼠源反转录酶(M—放阅读框，编码】1种蛋白，其中P14(C)、gP48、MLV)、rTaq酶、BamHl和HindⅢ限制性内切gP25(E1)、gP53(E2)4个蛋白为病毒结构蛋白，其余酶、T4DNA连接酶购

5、自宝生物工程(大连)有限公为非结构蛋白。。gP48(E0)、gP25(E1)、gP53司；质粒提取试剂盒与胶回收试剂盒购自天根生化(E2)3个结构蛋白因位于病毒表面，成为组成病毒科技(北京)有限公司；酶标二抗(兔抗牛和羊抗兔)、囊膜结构的3种囊膜蛋白。其中E2蛋白位于弗氏完全佐剂与不完全佐剂购自Sigma公司。病毒粒子的外表，含有病毒重要的抗原决定簇，是1．2方法病毒主要的免疫保护性抗原，能诱导机体产生保护1．2．1引物的设计及合成参照GenBank公布的性的中和抗体。⋯。鉴于此，本研究利用生物学软牛病毒性腹泻病毒基因组序列，设计一对E2蛋白特件分析E2基因结卡句，选取E2蛋白主要抗

6、原区域进异性表达引物：上游引物F53ATAGC-ATC行丁高效表达，并制备了多克隆抗体，为牛病毒性腹CGAATCTCCATTCGCCAAAA，下游引物R53泻病毒E2蛋白结构与功能研究，以及牛病毒性腹泻ATTCAAGCTTAGGGTTGGAAGGGCATAGGT新型疫苗与诊断制品的研制奠定基础。C，引物委托上海生工生物工程技术服务有限公司合成收稿日期：20】3-03～18作者简介：杨有武(1970一)，男，青海玉树州人，畜牧师，主要从事兽医临床诊断研究。杨有武等：牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的表达及多克隆抗体制备1291．2．2BVDV基因组RNA的提取及cDNA的合(HRP)标记兔抗牛

7、IgG抗体为二抗，以二氨基联苯成应用Trizol试剂盒说明书上的方法提取BVDV胺(DAB)为底物显色液，进行Westernblot检测。病毒基因组RNA，病毒基因组提取后以下游引物R1．2．9兔抗E2蛋白多克隆抗体的制备取2mg为反转录引物进行反转录反应，反转录体系(25／aL)纯化的重组E2蛋白与等体积的弗氏完全佐剂乳化包括：RNA模板5．0rtL，引物2．0／,L，5×buffer后经背部皮下多点注射免疫新西兰白兔，14d后取5．0／21，dNTP(