水稻HL-CMS中orf216蛋白的原核表达和多克隆抗体制备.pdf

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1、第29卷第3期华中农业大学学报Vo1．29No．32010年6月JournalofHuazhongAgriculturalUniversityJune2010。257~261水稻HL—CMS中orf216蛋白的原核表达和多克隆抗体制备胡婧程钢谭艳平王春台刘学群一中南民族大学生命科学学院／生物技术国家民委重点实验室，武汉430074摘要以常规基因重组技术，将off216基因克隆人含有内含肽标签的原核表达载体pTYB1中，得到重组质粒pTYB1一orf216，经鉴定正确后，转化至大肠杆菌ER2566感受态细胞，15℃下0．8mmol／LIPTG诱导15h后，SDS-PAGE检测到大小约85ku的

2、特异性蛋白条带，融合蛋白以可溶组分形式存在。融合蛋白经亲和纯化后制备多克隆抗体，Westernblot分析表明多克隆抗体具有较高的特异性，可与免疫原特异结合。关键词水稻；原核表达；亲和纯化；抗体中图分类号S511．035．3文献标识码A文章编号1000—2421(2010)03—0257—05植物细胞质雄性不育(cytoplasmicmalesterili—BT)型和红莲(Honglian，HL)型等主要类型[引。ty，CMS)是一种不能产生有活力花粉的遗传性刘学群等[9]克隆了一个与HL_CMS相关的基因片状_1]，在高等植物中，是一种常见的生物学现象。段HL-sp1。李丕顺_10_通过T

3、AIL-PCR获得HCMS通常是指核质互作型雄性不育，其雄性不育基s户1侧翼序列，并预测其下游有一个编码216个氨因是由细胞质基因和细胞核基因互作共同控制的，基酸的开放阅读框orf216。陈为等_1通过遗传转具有正、反交遗传效应，表现母性遗传特点。自化将orf216转入HL-CMS保持系YTB中，发现Rhoades等[2]第一次在玉米中观察到细胞质雄性不orf216的表达能导致花粉的败育。本研究根据育后，细胞质雄性不育成为研究植物母性遗传现象orf216的序列设计特异性引物，通过PCR扩增目的最好材料之一。的基因，将其克隆人原核表达载体进行高效表达，蛋细胞质雄性不育表现母性遗传特点，是通过细

4、白纯化后进行多克隆抗体制备，为进一步研究胞质遗传的，因此早期人们认为CMS是由线粒体orf216蛋白的表达、定位和定量等奠定基础。DNA(mitochondrialDNA，mtDNA)·或叶绿体1材料与方法(chloroplastDNA，cpDNA)所决定的。由于越来越多的植物细胞质雄性不育相关基因被克隆，发现1．1材料mtDNA与CMS直接相关l_3]。在T—CMS玉米中，1)试验材料。含有载体pTYB1和大肠杆菌存在编码一个13ku蛋白的T-urfl3基因l4]，这个(Escherichiacoli)ER2566感受态细胞的原核表达T_urf13蛋白定位于线粒体内膜上l6]。在甜菜不育I

5、MPACT-CN蛋白纯化系统购自NEB公司，携带系OwenCMS中，存在一个ATP合酶亚基编码基orf216基因的菌株由中南民族大学生物技术国家因atp6的5前导序列编码的35ku的蛋白，这个民委重点实验室提供。蛋白以五聚体或六聚体形式定位于线粒体内膜2)主要试剂。限制性内切酶NdeI和SapI、上E。rTaq酶、DNA连接酶和DNA分子质量Marker购根据恢、保关系，水稻CMS则可分为野败自TaKaRa(大连)公司；NC膜为Whatman公司产(wildabortive，WA)型、包台(ChinsurahBoroII，品；蛋白分子质量Marker和预染蛋白Marker购自收稿日期：201

6、0—01—04；修回日期：2010—05—07*国家“863”专题(2008AA10Z118)和国家自然科学基金项目(30771163)资助**通讯作者．E-mail：xqliuw@yahoo．corn．cn胡婧，女，1986年生，硕士研究生．研究方向：生化与分子生物学．E-mail：carrot451@163．corn258华中农业大学学报第29卷Fermentas公司；ECIWesternBlotSystem购自碧闭1h后，加入用封闭液制备的orf216蛋白抗体(稀云天(上海)公司。释度1／2000)4℃孵育过夜，用TBST洗膜2次，1．2试验方法TBS洗膜1次，每次10rain。加人用

7、封闭液制备的1)pTYB1一orf216原核表达载体的构建。设计羊抗兔IgG(稀释度1／1000)室温孵育1h，用引物通过PCR扩增得到目的基因片段，用Nde工和TBST洗膜2次，TBS洗膜1次，每次10min。使SapI双酶切回收目的基因片段，与同样用NdeI用凝胶成像仪进行ECL曝光，根据条带的位置是否和Sap工双酶切后回收的表达质粒pTYB1定向连符合预期orf216的大小判断抗体的特异性。接，用CaC