单克隆抗体技术.doc

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1、单克隆抗体技术(monoclonalantibody,McAb)一、原理历史：Kohler和Milstein(1975)将小鼠骨髓瘤细胞与用绵羊红细胞免疫小鼠后的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交瘤细胞既能产生抗绵羊红细胞抗体，又能进行分裂繁殖，创立了单克隆抗体杂交瘤技术。近20年来，它在生物学研究和医学临床诸多领域中被迅速推广应用，成为生物学研究三大实验技术之一(另两项为生物化学分离分析技术和DNA重组技术)。该项创造荣获1984年诺贝尔奖。概念：1.克隆(clone)是指无性繁殖细胞系或有机体群体。对细胞而言，是由单一个祖先细胞分裂繁殖而形成的一簇

2、细胞纯系。在这个家族的所有成员中，如无突变发生，其基因是完全相同的。2.单克隆抗体(monoclonalantibody，简称McAb)是指在一株B淋巴细胞系中的每个细胞只能产生一种它所专有的、针对一种它能识别的抗原决定簇的抗体，从这样一株B细胞系产生的抗体即为单克隆抗体。由于是一个细胞克隆分泌的抗体，因此易于分离纯化，这不仅有应用价值，而且对抗体分子的结构、功能的研究也有重大意义。对单克隆抗体B淋巴细胞进行细胞培养或小鼠体内繁殖，便可获得大量的、富集的特异抗体。这就避免了通过对动物免疫获得循环抗体的琐碎、繁重、重复的操作，也无须考虑动物对抗原免疫

3、反应的差异。在组织培养过程中加入同位素标记的氨基酸还可获标记的抗体。此外，单克隆抗体是由抗原某一决定簇诱导产生的，抗原专一性大为提高，对抗原结构的研究及临床鉴别诊断都具有实际意义。如何筛选融合细胞？——单克隆抗体技术的关键。1)核酸的代谢：主要途径与补救途径(关键酶：HGPRT、TK；原料H,T)2)HAT选择性培养基。A；H(次黄嘌呤核苷)；T(胸腺嘧啶核苷)。3)缺陷型骨髓瘤细胞筛选：HGPRT-/TK-。二、技术流程免疫小鼠(3~4周)骨髓瘤细胞↓(收集指数生长期细胞)强化免疫(3~4d)↓取脾制成细胞悬液细胞副合(50%PEG)(1周)

4、↓在微孔培养板HAT液中培养饲养细胞(2周)↓改为HT培养液(1周)↓检测抗体↓饲养细胞阳性孔细胞初次克隆化↓再次克隆化↓阳性杂交瘤扩大培养(2周)↓收集含McAb杂交瘤细胞液氮冻存杂交瘤细胞注入小鼠腹腔,上清液↓产生McAb高含量的腹水↓复苏↓鉴定↓提纯抗体再克隆