牛支原体分离株全基因组序列测定及初步分析.pdf

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1、动物医学进展，2014，35(8)：44—49ProgressinVeterinaryMedicine牛支原体分离株全基因组序列测定及初步分析王艳杰，李平安，吴太平，关平原¨(1．内蒙古农业大学兽医学院农业部动物临床诊疗技术重点实验室，内蒙古呼和浩特010018；2．内蒙古农业大学食品科学与工程学院，内蒙古呼和浩特010018)摘要：为全面了解牛支原体NM2012株的基因序列，研究其潜在的致病机制及其复制、转录、翻译过程的调控机制，采用体外大量培养，酚一氯仿法提取牛支原体NM2012株基因组DNA，并送往北京华大基因

2、公司进行全基因组测序注释。结果显示，牛支原体NM2O12株基因组大小为993483bp，GC含量为29．269／6，测序组装后共产生3个scaffolds，24个contigs。基因组组分分析后发现，NM2012株的基因组合有885个基因，总长度为834042bp，基因平均长度为942bp，占基因组全长的83．959／6。串联重复序列共79个，总长为9203bp，占基因组全长的0．9263。小卫星序列53个，微卫星序列5个，tRNA34个，rRNA4个。牛支原体NM2012株16SrRNA序列与支原体属致牛羊病主要菌

3、株构建进化树进一步证实NM2012株为牛支原体，为后期进一步研究牛支原体提供依据。关键词：牛支原体；酚一氯仿提取法；全基因组测序中图分类号：$852．62文献标识码：A文章编号：1007—5038(2014)08—0044—06牛支原体于1961年首次由Hale等从美国的患逃避宿主的免疫应答]。牛支原体引起疾病的临床乳腺炎的牛乳中分离到，1976年被确定为引起牛呼症状与丝状支原体丝状亚种引起的疾病即牛肺疫的吸系统疾病的病原之一，其引起的临床症状主要表症状非常相似。抗生素的大量使用导致疾病的非典现为乳腺炎、关节炎、肺炎

4、、角膜炎、不孕症甚至引起型症状出现，使得牛支原体与丝状支原体丝状亚种中耳炎]。牛支原体对牛的危害主要在于引起牛支的鉴别诊断越来越困难，牛支原体与无乳支原体16原体相关性疾病(MycoplasmaborisassociationsrRNA序列的同源性高，利用扩增16SrRNA目disease，MbAD)，即牛支原体感染后继发感染巴氏的片段也很难鉴别两者，这阻碍了牛支原体临床病杆菌等自然界常在菌往往会造成巨大的经济损失。例的诊断r4]。我国2011年和2012年分别完成了在欧洲，由牛呼吸道疾病引起的经济损失每年都高Hub

5、ei和HB0801两株牛支原体的测序，对Hubei达57600万欧元，而其中大约有1／4的经济损失与分离株与牛支原体PG45株比较发现，两者可能具牛感染支原体有关。在美国，每年由于牛支原体感有不同的执行基因水平转移的能力，HB0801株分染而引起的经济损失高达3200万美元，并且牛支离自有肺脏损伤的牛，并且牛体内试验证实其与牛原体感染已经成为欧洲和北美洲地区牛发病和死亡支原体PG45具有相同的毒力，其具有惊人的基因的重要原因之一]。2008年我国首次报道从患肺组可塑性l_5J。炎的犊牛病例中分离得到牛支原体，随后不断

6、有牛牛支原体NM2012菌株分离自消瘦，胸部皮下水肿，四肢腕关节、膝关节和跗关节明显肿大的犊支原体被分离鉴定的报道，因而牛支原体引起的疾牛，处死后采集关节液病料分离菌株，经形态学观病未来可能会成为我国养牛业的重大隐患。察、生化鉴定以及特异性PCR鉴定为牛支原体，命牛支原体是柔膜体纲支原体目支原体科支原体名为NM2012菌株。属的一员，形成典型菌落形态为煎蛋样，无细胞壁，G+c含量低，仅由3层膜构成，形态多样，对外界1材料与方法环境抵抗力低，但其却广泛存在于自然界。有学者1．1材料认为，这可能与其可变表面脂蛋白家族有关

7、。可变1．1．1茵株来源分离自患疑似支原体病犊牛的表面脂蛋白家族是指一类大小和抗原表位具有高频关节液病料，由内蒙古农业大学兽医学院动物传染变异性的蛋白，它造成牛支原体表型的多样性，从而病学实验室分离、鉴定、保存并命名为牛支原体收稿日期：2014—02—13作者简介：王艳杰(1988一)，女，内蒙古赤峰人，硕士研究生，主要从事牛支原体病的研究。*通讯作者王艳杰等：牛支原体分离株全基因组序列测定及初步分析45NM2012菌株。3端带有“T”碱基的特殊接头连接，用电泳法选择需1．1．2培养基PPLO(21g／L)121℃高

8、压灭菌回收的目的片段连接产物，再使用PCR技术扩增两20min，由马血清(200mL／L)、250g／L的酵母粉端带有接头的DNA片段；③用合格的文库进行(100mL／L)、10单位青霉素(10g／L)组成，cluster制备和测序，测序后数据首先进行数据过滤pH7．6，若配制固体培养基，则加12g／L的琼脂。获得CleanData，采用S0A