直接竞争酶联免疫吸附-高效液相色谱法测定烯效唑.pdf

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1、第4O卷分析化学(FENXIHUAXUE)研究报告第11期2012年11月ChineseJournalofAnalyticalChemistryl73O～1734直接竞争酶联免疫吸附一高效液相色谱法测定烯效唑张良王泉振王宁刘曙照(扬州大学园艺与植物保护学院，环境科学与工程学院，扬州225009)摘要应用本实验室制备的对烯效唑具特异性亲和力的多克隆抗体，采用包被抗体直接竞争模式建立烯效唑的酶联免疫吸附分析法。在优化条件下，对烯效唑标样检测的线性范围为1～10mg／L，线性中浓度为1．3lL，5次重复测定的相对标准偏差(RSD)为8．4％；检出限为0．022g／L。在苹果中分别

2、添加烯效唑标样1．0，0．1和0．01mg／kg；直接竞争ELISA法测定的回收率分别为84．6％～101．0％，99．6％～117．0％和80．8％～92．8％；RSD(，z一5)分别为8．6％，6．9％和6．7％。ELISA法对苹果中烯效唑的检出限为0．024p,g／kg。在同样前处理条件下，高效液相色谱一紫外检测(HPLC-UVD)法对苹果中烯效唑的检出限为0．25mg／kg，苹果中添加1．O0mg／kg烯效唑，HPLC-UVD法测定的回收率为92．6％。关键词烯效唑；苹果；直接竞争酶联免疫吸附分析；高效液相色谱1引言烯效唑(Uniconazole，结构式见图1)是一

3、种广谱、高效植物生长调节剂，高浓度时兼有杀菌和除草作用。烯效唑通过抑制赤霉素合成，控制植物的营养生长，缩短节间长度、矮化植株，具有增进植物抗逆性、提高产量的作用】，在农作物、果树、蔬菜、烟草、花卉等作物上应用广泛口】。OH烯效唑在作物体内较为稳定，残效期长，残留于作物体内可能对人体健康产生不利影响。另外，残留于土壤中的烯效唑对土壤中微生物的活性也会造成显著影响]。日本规定，粮果中烯效唑的最大残留限量N—N(MRL)为0．01mg／kg。因此，建立高效快速、高灵敏度的烯效唑残留监测方图1烯效唑结构式法，对保障人体健康和农产品国际贸易的顺利进行等具有重要意义。Fig．1Stru

4、ctureofuniconazole目前，烯效唑残留检测主要采用气相色谱法和高效液相色谱法【6~。仪器分析法具有准确可靠等优点，但需要比较昂贵的设备、专业化的实验室和训练有素的专门人才，对样品前处理的要求高，难以适应大量样本和现场快速检测的要求。酶联免疫吸附分析法(ELISA)具有特异性强、灵敏度高、样品容量大、分析成本低、样品前处理步骤简便等特点，在大量样本和现场样本快速筛选监测中显示出独特优势。本研究应用本实验室制备的对烯效唑具有特异性亲和力的抗体，采用包被抗体、酶标记半抗原直接竞争模式，在优化条件下，建立了烯效唑的ELISA法，并用于苹果中烯效唑的测定，简化了样品前处

5、理和操作步骤，缩短了检测时问，实现了高灵敏度、高特异性的快速检测。同时采用高效液相色谱一紫外检测(HPLC—UVD)法进行了对比分析，结果满意。2实验部分2．1仪器、试剂与材料高效液相色谱仪(美国Waters公司)；PrimoR高速冷冻离心机(德国Heres公司)；Model680酶标仪(美国BIO—RAD公司)；DK-S28电热恒温水浴锅(上海精宏实验设备有限公司)；Tappets单道可调移液器：5～50L，20~200L，100～1000L(芬兰)，Transferpettte-8道可调移液器(德国)；96孔酶标板(浙江黄岩)；XW-80A旋涡混合器(上海青浦沪西仪器厂

6、)；YXQ．SG41．280手提式压力蒸汽灭菌器(上海华线医用核子有限公司)；搅拌机(广东美的精品电器制造有限公司)。2012-02—15收稿；2012-05—22接受本文系863专题课题(No．2009AA03Z331)和国家自然科学基金(No．20777064)资助项目E-mail：szliu@yzu．edu．cn第11期张良等：直接竞争酶联免疫吸附一高效液相色谱法测定烯效唑烯效唑(Uniconazole)：有效成分含量91．5％(盐城利民农化有限公司)；抗烯效唑抗体：本实验室以烯效唑衍生物与BSA偶联制备人工抗原免疫制备多克隆抗体；烯效唑酶标半抗原：本实验室制备；包被

7、液：0．02mol／L磷酸盐缓冲液(PB，pH6．8)；封闭液：本实验室制备；反应液：O．02mol／LPBS(pH6．8，含0．15mol／LNaC1)；洗涤液：灭菌蒸馏水；显色液A：120mg过氧化脲溶于1000mL柠檬酸一磷酸盐缓冲液(5．2g柠檬酸、8．4gNa：HPO溶于灭菌水，并定容至1000mL)；显色液B：200mg3，3，5，5，_四甲基联苯胺(TMB)溶于20mLN，N一二甲基甲酰胺(DMF)，用柠檬酸一磷酸盐缓冲液定容至1000mL；临用前将A液和B液按体积比1：1混匀；终止液：2mol／LH