大肠杆菌分子克隆载体.ppt

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1、第三节大肠杆菌分子克隆载体一、E.coli克隆载体的种类1.质粒载体—复制起点来自一些天然质粒。2.噬菌体载体—λ，P1和M13、fd载体，复制起点来自噬菌体。3.COS质粒载体—质粒载体中插入λcos片段，以利于体外包装4.噬粒载体（phagemid）—有质粒和M13、fd的复制起点，以质粒或噬菌体方式复制。二、质粒与质粒载体1.E．coli的质粒种类1)colE1因子（大肠杆菌素因子）—多数不能进行接合转移DNA，属高拷贝松弛型。2)R因子（抗药性因子）可接合转移DNA，属低拷贝严紧型，质粒较大，操作不便3)F因子（性因子）2.质粒的特点1)质粒D

2、NA复制与染色体复制无关2)质粒DNA以超螺旋形式存在3)质粒DNA可以接合转移4)质粒的不相容性和不相容群5)质粒DNA的消除—化学和物理法(吖啶染料，EtBr，高温等)6)质粒的整合—F因子又可整合到E.coli染色体中3.质粒DNA的转移1）质粒DNA的转移过程质粒的自主转移过程质粒DNA的转移和复制2）质粒转移的必备条件ⅰ.转移起点(oriT),它是质粒DNA转移时的复制起点—顺式作用（cis-action）ii.细胞附属物—性纤毛，由蛋白质构成—反式作用ⅲ.转移过程所需的全部酶类—反式作用3）质粒转移类型ⅰ.自我转移（Self-transmi

3、ssible）ⅱ.辅助转移（Donation）—可转移质粒仅具备oriT，若无辅助质粒，前者不会发生接合转移。若辅助质粒可提供所有反式作用的蛋白质，前者便会发生接合转移。ⅲ.重组转移（conduction）—若质粒无oriT，该质粒只有整合到辅助质粒DNA中，重组质粒便可转移。因此，用于克隆外源DNA的分子克隆载体，只要具备oriT即可，另外两类功能基因可置于辅助质粒上，该质粒一般没有oriT，因而可以减少后者进入另一种细胞的频率。质粒自主转移质粒的辅助转移质粒的重组转移R-重组DNA分子4.质粒DNA的复制和调节控制1)复制机制—复制方向、终止和方式

4、2)质粒拷贝数的控制—抑制剂模型：高拷贝质粒需高浓度抑制剂，低拷贝质粒需低浓度抑制剂，同一不相容群质粒产生的抑制剂可交叉相互作用。3)质粒的复制调控机制例子:ColE1质粒的复制及复制起点结构Borosetal.(1984)分离到一个pBR322突变体，其拷贝数可达1000/cell或65%总DNA，原因是在RNAI基因的3'端附近发生一次G→T颠换。ColE1质粒复制起点结构质粒DNA的复制过程5.大肠杆菌质粒载体1)常用质粒载体的复制子质粒载体复制子来源拷贝数pBR322系列pMB115-20pUC系列pMB1500-700pACYC系列p15A1

5、0-12pSC101系列pSC10125colE1colE115-202)质粒载体常用的遗传标记基因AprCmrKanrNeorTcrHygrLacZLacZα3)多克隆位点区大多数从pUC系列中的多克隆位点衍生出来的6.实例—pUC18和pUC19pUC系列质粒载体由Messingetal.构建，具有三个显著特点：1）分子量小，仅为2.7KB，容纳外源DNA量增大2）易于检测是否有外源DNA插入的标记基因LacZα3）多克隆位点区ⅰ.多克隆位点成对地存在于pUC18和pUC19中，位点排列顺序相同，但方向相反。这种排列方式有利于外源DNA的克隆和定向

6、插入ⅱ.产生不同末端规律排列:两端限制酶位点产生5’—突起端（EcoRI和HindⅢ），与之相邻的两个限制酶位点产生3’—突起端（SstI、KpnI、SphI、PstI），中央四个限制酶位点产生5’—突起端或平端。这种排列方式十分有利于插入DNA片段的单向缺失和缺失片段的回收。pUC18和pUC19载体如插入片段的5’段定向缺失:XbaI→SphI→ExoⅢ→S1→T4DNAlingase;插入片段的3’-端亦可采用类似的方法进行缺失（SmaI→SstI→ExoⅢ→S1→T4DNAlingase）不同载体中的多克隆位点区可以供不同目的片段的重组。又例如

7、:pBS+多克隆位点区的排列顺序是(见图)：假设有一EcoRI→HindⅢDNA片段，并要求在其3’-末端或5’-端接上另外的DNA片段（如终止子、启动子），显然，pUC系列载体的多克隆位点区是不太适宜，但选用pBS+中的多克隆位点区就能满足要求。ⅲ.多克隆位点集中排列，有利于克隆片段的物理图谱的绘制。除上述三个特点外，pUC系列载体还可用于表达外源基因（LacZα启动子）。pBS载体的结构三.噬菌体载体1.噬菌体λ载体1）λ的结构和特点i.一般结构：48,502bp，线状ds-DNA，两端具有12n.t5‘-突起（5’-GGGCGGCGACCT-3’

8、）该末端称为cos位点，可被λ编码的末端酶所识别（该酶由λ末端的两个基因Nul和A编码蛋白gp