过氧化氢酶(CAT)活性的测定.doc

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1、过氧化氢酶（CAT）活性的测定：紫外吸收法一、目的与要求过氧化氢酶普遍存在于植物的所有组织中，其活性与植物的代谢强度及抗寒、抗病能力有一定关系，故常加以测定。二、原理过氧化氢酶（catalase）属于血红蛋白酶，含有铁，它能催化过氧化氢分解为水和分子氧，在此过程中起传递电子的作用，过氧化氢则既是氧化剂又是还原剂。可根据H2O2的消耗量或O2的生成量测定该酶活力大小。过氧化氢在240nm波长下有强烈吸收，过氧化氢酶能分解过氧化氢，使反应溶液的吸光度（A240）随反应时间而降低。根据测量吸光率的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性。三、材料、仪器设备及试剂（一）材料：小麦或其它叶片（二）仪器设备：1

2、.研钵；2.紫外分光光度计；3.离心机；4.恒温水浴；5.容量瓶。（三）试剂：1.0.2mol/LpH7.8磷酸缓冲液（pH7.8:0.2mol/LNa2HP0491.5ml;0.2mol/LNaH2P048.5ml）；2．0.1mol/LH2O2(30%的H2O2溶液5.68ml稀释至1000ml)二、实验步骤：1、酶液提取称取新鲜植物叶片或其它组织0.5g，置于研钵中，加入2～3ml4℃下预冷的pH7.0磷酸缓冲液和少量石英砂研磨匀浆后，转入25ml容量瓶中，并用缓冲液冲研钵数次，合并冲洗液，并定容到刻度。混合均匀，将容量瓶置5℃冰箱中静置10min，取上清液在4000r/min下离心1

3、5min，上清液即为过氧化氢粗提液，5℃下保存备用。2、测定10ml试管3支，其中2支为样品测定管，1支为空白管，按表1-1顺序加入试剂。25℃预热后，逐管加入0.6ml0.1mol/l的H2O2,每加完1管立即记时，并迅速倒入石英比色杯中，260nm下测定吸光度，每隔1min读数1次，共测4min，待3支管全部测完后，按式（1-1）计算酶活性。表1-1紫外吸收法测H2O2样品测定液配制表管号S1S2S0空白粗酶液（ml）0.40.40.4(失活酶液)0.4（磷酸缓冲液）PH7.8磷酸缓冲液（ml）3.03.03.03.0蒸馏水（ml）2.02.02.02.03、结果计算以1min内A240

4、减少0.1的酶量为1个酶活单位（μ）。过氧化氢酶活性（μ.g-1min-1）=ΔA240*Vt/(0.1*Vl*t*FW)（1-1）式中ΔA240：As0-(As1+As2)/2;As0：加入失活酶液的对照管吸光值；As1，As2：样品管吸光值；Vt：粗酶提取液总体积（ml）；Vl：测定用粗酶提取液体积（ml）；FW：样品鲜重（g）；0.1：A240每下降0.1为1个酶活单位（μ）；t：过氧化氢到最后一次读数时间（min）