过氧化氢酶活性测定1

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1、实验48过氧化物酶活性的测定（比色法） 过氧化物酶是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶，它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有密切关系，在植物生长发育过程中，它的活性不断发生变化，因此测量这种酶，可以反映某一时期植物体内代谢的变化。一、原理在有过氧化氢存在下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶褐色物质，该物质在470nm处有最大吸收，可用分光光度计测量470nm的吸光度变化测定过氧化物酶活性。二、实验材料、试剂与仪器设备（一）实验材料马铃薯块茎。（二）试剂1．100mmol／L磷酸缓冲液pH6.0（见附录）。2．反应混合液：100mmol／L磷酸缓冲液（pH6.0）50

2、mL于烧杯中，加入愈创木酚28μl，于磁力搅拌器上加热搅拌，直至愈创木酚溶解，待溶液冷却后，加入30%过氧化氢19μl，混合均匀，保存于冰箱中。（三）仪器设备分光光度计，研钵，恒温水浴锅，100mL容量瓶，吸管，离心机。三、实验步骤1．称取植物材料1g，剪碎，放入研钵中，加适量的磷酸缓冲液研磨成匀浆，以4000r／min离心15min，上清液转入100mL容量瓶中，残渣再用5mL磷酸缓冲液提取一次，上清液并入容量瓶中，定容至刻度，贮于低温下备用。2．取光径1cm比色杯2只，于1只中加入反应混合液3mL和磷酸缓冲液1mL，作为对照，另1只中加入反应混合液3mL和上述酶液1mL（

3、如酶活性过高可稀释之），立即开启秒表记录时间，于分光光度计上测量波长470nm下吸光度值，每隔1min读数一次。四、结果计算以每分钟吸光度变化值表示酶活性大小，即以ΔA470/[min·g（鲜重）]表示之。也可以用每min内A470变化0.01为1个过氧化物酶活性单位（u）表示。过氧化物酶活性[u/（g·min）]=式中：ΔA470——反应时间内吸光度的变化。W——植物鲜重，g。VT——提取酶液总体积，mL。Vs——测定时取用酶液体积,mL。t——反应时间，min。POD（过氧化物酶）活性的测定使用愈创木酚比色法。（1）酶液提取（2）活性测定2.9mL0.5mol/LpH6.

4、0磷酸缓冲液，加入1mL0.05mol/L愈创木酚和0.1mL酶提取液，30℃水浴保温15min后迅速放入冰浴中，立即加入1mL2%的H2O2（0.667mL30%H2O2溶于100mL蒸馏水，现配现用。）激活反应，立即在470nm下测定吸光度值，每隔30s记录一次吸光度，共记录5次。试验重复2次取平均值记录。（3）酶活力的计算：以每秒钟内OD值变化0.01为一个酶活力单位（U），酶活性用U/(mg·min)表示。其中：------反应时间内吸光度的变化值------稀释倍数（，其中取用体积为0.1mL）------反应时间（本实验为30S）愈创木酚法称取一定质量的植物材料放

5、入研钵中，加入提取液1mL(0.05mol/LpH5.5的磷酸缓冲液)，研磨，再加入9mL提取液，将匀浆全部转入离心管中，4000r/min4℃离心10min，上清液即酶的粗提取液。测定酶活性时，将4mL反应混合液(磷酸缓冲液2mL、酶液1mL、0.05mol/L愈创木酚1mL)和1mL2%H2O2加入试管中立即摇匀并迅速倒入比色皿中，于470nm波长下用U-2800型紫外可见分光光度计比色，立刻记录吸光度值，以后每30s记录1次，记录4min，以缓冲液代替酶液作对照，POD活性=V1·ΔOD/0.01V2W·Δt式中:ΔOD为反应初速度阶段的吸光度差，比色波长470nm;Δ

6、t为ΔOD对应的时间(min);ΔOD/Δt为直线部分的斜率，在此阶段吸光度与反应时间成正比;V1为提取酶液总体积(mL);V2为测定时取用的提取酶液体积(mL);W为植物样品鲜重(g);0.01为以吸光度值(ΔOD)变化0.01为1个酶活性单位(u)。过氧化氢酶活性的测定．取0.2ｇ去壳种子，液氮中研磨成粉，然后加入提取液(50mmol/L，pH7.0的磷酸缓冲液，20%甘油，1mmol/L还原型谷胱甘肽，2mmol/L抗坏血酸，1%聚乙烯吡咯烷酮)5mL继续研磨成匀浆，4℃，10000r/min离心15min.在1mL反应体系(10mmol/L，pH7.0磷酸钾缓冲液，1

7、0mmol/LH2O2)中加入适量酶提取液，混匀后在240nm下测定OD值.过氧化氢酶活性以每分钟每克鲜重样品分解H2O2的毫克数表示