过氧化氢酶活性的测定

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1、过氧化氢酶活性的测定——碘量法实验三学时：3生物体内重要的三种氧化酶类，其作用均是清除体内自由基：POD：过氧化物酶SOD：超氧化物歧化酶CAT：过氧化氢酶1、掌握碘量法测定过氧化氢酶活性的原理和方法；2、了解过氧化氢酶的作用。一、实验目的：植物在逆境下或衰老时，由于体内活性氧代谢加强而使H2O2发生累积。H2O2可进一步生成氢氧自由基（OH˙）。氢氧自由基（OH˙）是化学性质最活泼的活性氧，可以直接或间接地氧化细胞内核酸，蛋白质等生物大分子，并且有非常高的速度常数，破坏性极强，可使细胞膜遭受损害，加速细胞

2、的衰老和解体。过氧化氢酶(catalase；CAT)可以清除H2O2、分解氢氧自由基，保护机体细胞稳定的内环境及细胞的正常生活，因此CAT是植物体内重要的酶促防御系统之一，其活性高低与植物的抗逆性密切相关。二、实验原理:CAT活性大小以一定时间内分解的H2O2量来表示：在一定条件下，CAT能把H2O2分解为H2O和O2。当CAT与H2O2反应一定时间(t)后，再用碘量法测定未分解的H2O2，以钼酸铵作催化剂，H2O2与KI反应，放出游离碘，然后用硫代硫酸钠滴定碘，反应式为：H2O2（余）+2KI+H2SO4

3、----→I2+K2SO4+2H2OI2+2Na2S2O3--→2NaI+Na2S4O6（连二硫酸钠）用硫代硫酸钠分别滴定空白液(可求出总的H2O2量)和反应液(可求出未分解的H2O2量)，再根据二者滴定值之差求出分解的H2O2量。二、实验原理:1、实验材料：三叶草2、仪器：(1)滴定管(2)研钵(3)容量瓶(4)移液管(5)三角瓶(100ml)3、试剂：（1）0.05MH2O2（2）0.2MNa2S2O3（3）1.8MH2SO4（4）1.5%淀粉溶液（5）10%（NH4)6Mo7O24（6）20%KI（7

4、）CaCO3，石英砂三、实验材料、仪器和试剂：1、酶液提取：称取0.5g三叶草，加少量石英砂，CaCO3，2ml水，研成匀浆，移入50ml容量瓶，冲洗研钵数次，定容，静置，过滤。2、酶促反应：（1）取锥形瓶2个，编号A，B，各加入10ml酶液，之后立即向A瓶中加入1.8mol/LH2SO45ml，终止酶活性，作空白滴定。（2）向A，B两瓶各加H2O25ml，摇匀，在加入B瓶那一刻起，记录时间，5分钟后迅速向B瓶中加入1.8mol/LH2SO45ml，终止酶活性。3、滴定：向A，B两瓶各加1ml20%KI和3

5、滴（NH4）6Mo7O24，摇匀后迅速加入5滴1.5%淀粉溶液，用Na2S2O3进行滴定至蓝色恰好消失，记录两次消耗Na2S2O3的体积VA(空白)，VB(反应液)。四、实验步骤：酶活性测定管号酶液(ml)1.8MH2SO4(ml)0.05MH2O2保温1.8MH2SO4(ml)20%KI溶液(ml)钼酸铵溶液(滴)淀粉溶液(滴)0.2MNa2S2O3溶液的滴定量A空白10555分钟-135VA(空白)=B反应10-55135VB(反应液)=1、被分解的H2O2量（mg）=（空白滴定值-样品滴定值）×Na2

6、S2O3摩尔浓度×172、CAT活性（mg.g-1.min-1）=被分解的H2O2量（mg）×(总体积÷测定取液量)样品重（g）×时间（min）五、实验结果与计算：六、思考题：1、本实验中影响CAT活性测定的因素有哪些？