实验4和5 苜蓿愈伤组织诱导.pdf

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1、实验四、苜蓿无菌苗的培养实验五、苜蓿愈伤组织诱导【目的要求】：1、学会种子的消毒方法；2、学习接种操作技术规范。【实验内容】：1、种子的挑选；2、种子的消毒；3、接种技术；4、离体培养；5、学会辨别下胚轴的方法并了解组织培养外植体的选择；6、利用离体培养技术建立了多种植物的无性繁殖体系。【实验用具】：超净工作台、酒精灯、平皿、三角瓶、枪形镊、标签纸、记号笔、pH试纸等。【实验药品】：各种盐类以及有机物质按照MS培养基配方准备，0.1%氯化汞，蔗糖，琼脂。【实验方法】：1、种子的挑选原则：挑选饱满

2、有光泽的成熟种子2、种子的消毒：(1)清水冲洗3遍；以下在无菌工作台进行(2)75％酒精浸泡30秒，将酒精倒入废液缸；(3)0.1％的氯化汞浸泡12分钟，将废液倒入废液缸；(4)再用无菌水清洗3边，废水倒入废液缸；(5)将消毒好的种子平分到带滤纸的培养皿中。3、接种（无菌工作台）(1)取装有MS培养基的培养瓶，用酒精棉球将瓶外擦拭消毒，同时将手及台面擦拭消毒；(2)将种子均匀整齐接入培养瓶，包好封口纸；4、培养：将接种好的培养瓶送入培养间25±2℃光照培养3－7天。5、愈伤组织的诱导：将苜蓿幼芽

3、从培养瓶取出放入带有滤纸的培养皿中，用手术刀截取下胚轴；再将下胚轴截成3－5mm小段，均匀整齐接入盛有MS附加激素2,4-D和6-BA的培养瓶。6、愈伤组织的培养：将接好的培养瓶送入培养间25±2℃暗培养3周继代。思考题：1、愈伤组织诱导污染调查:观察污染情况，填入下表：观接污污主观察日期接种数污染数污染率主要污染菌种污染率（%）=（污染的外植体数/总接种外植体数）×100％2、外植体用消毒剂消毒后，为什么要用无菌水漂洗？3、在接种过程中，通过哪些措施来防止细菌对接种工具，接种材料的污染？4、对

4、外植体表面消毒时为什么常用“两次消毒法”？5、观察接种的外植体在接种1周后产生愈伤组织的颜色和质地，计算愈伤组织诱导率。愈伤组织诱导率（%）=（形成愈伤组织的材料数/总接种材料数）×100%6、分析影响愈伤组织诱导和分化的主要原因。