实验四 电镜切片制作与观察.doc

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1、实验四电镜切片制作与观察实验目的v了解扫描电镜生物样品的常规制备技术，重点掌握样品的表面处理方法，临界点干燥仪和离子溅射仪的结构与工作原理。v了解生物样品超薄切片的一般制备技术，重点掌握包埋与聚合、玻璃刀的制作、修块、铜网及其支持膜、切片厚度判断等。v了解H-7000透射电镜的结构及其工作原理，重点是镜筒系统。实验原理1、电子束的特点穿透能力有限，不超过100nm。2、电子成像机制电子成像的反差主要源于样品散射电子能力的差异。3、生物样品的特点含水量高、质地柔软、对热和电子束敏感，散射电子的能力弱且差异小。4、扫描电镜及常规扫描电镜生物样品制备技术

2、（1）扫描电镜扫描电镜是一种利用电子束扫描样品表面从而获得样品信息的电子显微镜。扫描电镜由三大部分组成：真空系统，电子束系统以及成像系统。（2）扫描电镜样品制备要求扫描电镜以观察样品的表面形态为主。扫描电镜样品的制备，必须满足以下要求：保持完好的组织和细胞形态；充分暴露欲观察的部位；良好的导电性和较高的二次电子产额；保持充分干燥的状态。（3）扫描电镜样品制备流程某些含水量低且不易变形的生物材料，可以不经固定和干燥而在较低加速电压下直接观察，如动物毛发、昆虫、植物种子、花粉等。对大多数的生物材料，则应首先采用化学或物理方法固定、脱水和干燥，然后喷镀碳

3、与金属以提高材料的导电性和二次电子产额。具体步骤包括：取材、清洗、固定、脱水、干燥（置换）、粘托、导电处理等。5、透射电镜及超薄切片制备技术（1）透射电镜透射电镜是利用透射电子成像的电子显微镜。透射式电子显微镜的总体结构包括镜体和辅助系统两大部分，镜体部分包含：照明系统（电子枪和聚光镜）、成像放大系统（样品室、物镜、中间镜和投影镜）、观察记录系统（观察室、照相室）。辅助系统包含：真空系统（机械泵、扩散泵和真空阀）、电路系统（电源变换和调整控制）、水冷系统。（2）透射电镜样品制备要求样品彻底干燥、要提高样品反差、样品要薄。（3）超薄切片制备技术由于一

4、般透射电镜的电子束穿透能力较弱，必须把标本切成厚度小于100nm的薄片，这种薄片称为超薄切片，超薄切片的厚度通常为50-70nm。超薄切片的制作流程与石蜡切片类似，包括取材、固定、脱水、渗透、包埋、聚合、修块、切片、染色等步骤。实验步骤1、常规扫描电镜样品制备技术（1）基本方法（2）样品观察面的处理方法²一般表面处理方法²样品断裂面处理方法（3）干燥的干燥方法²自然干燥法²真空干燥法²冷冻真空干燥法²临界点干燥法（临界点干燥仪）（4）样品的导电处理²真空镀膜法²离子溅射镀膜法（离子溅射仪）²组织导电技术2、超薄切片制备技术（1）、基本方法取材→漂洗

5、（生理盐水→前固定（2.5%戊二醛，4oC冰箱2小时以上）→漂洗（0.1M磷酸缓冲液/3次/45分钟）→后固定(1%锇酸1小时左右)→漂洗（0.1M磷酸缓冲液/3次/45分钟）→梯度脱水→浸透、包埋聚合→超薄切片→饱和醋酸铀染色30分钟，柠檬酸铅染色5-8分钟。透射电镜样品制作操作流程图（2）半薄切片²玻璃刀²半薄切片机²修块（3）超薄切片²工具：超薄切片机、钻石刀、水槽²超薄切片流程：切片→捞片→拨片→载网²切片厚度（切片干涉色）样品²载网²支持膜（4）电子染色²醋酸双氧铀染色及铀污染²柠檬酸铅染色及铅污染3、H-7000型透射电子显微镜的主要结

6、构（1）镜筒结构电子控制系统（2）电子光学系统在这个系统中，主要包括共用电源、高压电源、透镜电源、束偏转电源、控制电路、相机电源以及CRT显示电路。（3）真空系统和冷却系统真空系统H-7000透射电镜的真空系统是有两套真空线路构成的，因此，它拥有两套抽真空设备，即两三台油旋转泵和两台油扩散泵；其他组成部分包括：真空管道、预抽管道、预抽室(胶片干储装置)、潘宁规(PE)、普拉宁规(PL)、抽真空指令装置和保险装置。冷却系统包括：冷却水循环装置和整机冷却管道。4、上机操作观察到的视野实验结论思考题：1、对比石蜡切片制作，描述常规扫描电镜生物样品制备流程

7、、透射电镜超薄切片制作流程。扫描电镜生物样品主要分两大类，一类为含水量少的硬组织，如毛发、牙齿及植物的花粉、孢子、种子等。此类样品一般含硅质、钙质，角质，砝琅质和纤维素等成份，所以通常只经过表面清洁、装台(粘胶)、导电处理等简单过程即可进行观察。如要观察其断面或内部结构时，经断裂、解剖或酶消化、蚀刻等再装台、镀膜处理，即可进行观察拍照。另-类为含水分较多的软组织，如大多数的动植物器官、组织及细菌等均属此类。对于此类样品，在金属镀膜前，一般都需经过固定、脱水、干燥等处理，如不经处理或处理不当，就会造成样品损伤和变形，出现各种假像，因此对每一处理步骤都

8、应给予重视。超薄切片技术由于电镜产生的电子束穿透能力很弱，必须把标本切成厚度小于0.1um以下的薄片才适用，这种薄片称为超