染色体步移步骤.doc

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1、染色体步移技术（GenomeWalking）是一种重要的分子生物学研究技术，使用这种技术可以有效获取与已知序列相邻的未知序列。染色体步移技术主要有以下几方面的应用：  1.根据已知的基因或分子标记连续步移，获取人、动物和植物的重要调控基因，可以用于研究结构基因的表达调控。如分离克隆启动子并对其功能进行研究；2.步查获取新物种中基因的非保守区域，从而获得完整的基因序列；3.鉴定T-DNA或转座子的插入位点，鉴定基因枪转基因法等转基因技术所导致的外源基因的插入位点等；4.用于染色体测序工作中的空隙填补，获得完整的基因组序列；5.用于人工染色体PAC、YAC和

2、BAC的片段搭接。其主要原理是根据已知DNA序列，分别设计三条同向且退火温度较高的特异性引物（SP Primer），与退火温度较低的兼并引物，进行热不对称PCR反应。现在有很多GenomeWalkingKit，相应的说明书都介绍的很详尽，下面给你发一个原理图：大致的原理是这样的，依据TaKaRa的试剂盒，具体的操作步骤如下：1.基因组DNA的获取。基因组DNA的质量是侧翼序列获取成功与否的关键因素之一。建议不要使用只经过简单处理的基因组DNA（例如：只进行细胞热处理或蛋白酶处理）作为模板，而要使用经过充分纯化的完整的基因组DNA。此外，由于本方法灵敏度极

3、高，模板DNA一定不要污染，所需的DNA量不要少于3μg。2.已知序列的验证。在进行PCR实验之前必须对已知序列进行验证，以确认已知序列的正确性。具体方法为：根据已知序列设计特异性引物（扩增长度最好不少于500bp），对模板进行PCR扩增，然后对PCR产物进行测序，再与参考序列比较确认已知序列的正确性。3.特异性引物的设计。根据验证的已知序列，按照前述的特异性引物设计原则设计三条特异性引物，即：SP1、SP2、SP3。4.1stPCR反应。基因组DNA经OD测定准确定量后，取适量作为模板（不同物种的最佳反应DNA量并不相同，实际用量参考下面的注*1），以

4、AP Primer（四种中的任意一种，以下以AP1 Primer为例）作为上游引物，SP1Primer为下游引物，进行1stPCR反应。①  按下列组份配制1stPCR反应液。Template（基因组DNA） x ng*1                   dNTPMixture（2.5mΜeach） 8 μl             10×LAPCRBufferII（Mg2+ plus）               5 μlTaKaRaLATaq®（5U/μl）               0.5 μlAP1Primer（100pmol/μl）   

5、               1 μlSP1Primer（10pmol/μl）                     1 μldH2O                                 upto50 μl ② 1stPCR反应条件如下：94℃        1min      98℃          1min      94℃        30sec      60~68℃*21min          5Cycles72℃        2~4min*3   94℃        30sec； 25℃        3min； 72

6、℃     2~4min*3       94℃        30sec； 60~68℃*2   1min； 72℃     2~4min*394℃        30sec； 60~68℃*2   1min； 72℃     2~4min*3      15Cycles94℃        30sec； 44℃        1min； 72℃     2~4min*372℃        10min      5.2ndPCR反应。将1stPCR反应液稀释1~1000倍后，取1 μl作为2ndPCR反应的模板，以AP1Primer为上游引物，SP2

7、Primer为下游引物，进行2ndPCR反应。①按下列组份配制2ndPCR反应液。Template（1stPCR反应液）    1 μl*4                  dNTPMixture（2.5mΜeach)               8  μl10×LAPCRBufferII（Mg2+ plus）              5 μlTaKaRaLATaq®（5U/μl）                 0.5 μlAP1Primer（100pmol/μl）                  1 μlSP2Primer（10pmol/μl）

8、                 1  μl    dH2O