课题3 血红蛋白的提取和分离(上课)课件.ppt

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1、血红蛋白本课题学习目标体验从复杂体系中提取生物大分子的基本过程和方法，并了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理。1、主要概念：①凝胶色谱法②电泳法③缓冲溶液④它们在血红蛋白的提取中分别起到什么作用。2、主要原理：①凝胶色谱法分离蛋白质的原理②电泳法分离样品的原理③缓冲溶液的组成和作用机理3、课题重点：凝胶色谱法的原理和方法4、课题难点：①样品的处理②色谱柱填料的处理和色谱柱的装填。1、凝胶色谱法凝胶色谱法也称为分配色谱法，它是根据分子量的大小分离蛋白质的方法之一，又称分子筛层析。凝胶实际上是一些微小的多孔

2、球体，例如：浮石、琼脂、琼脂糖、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、葡聚糖凝胶等一、基本概念及原理原理：当不同的蛋白质通过凝胶时相对分子质量较小相对分子质量较大凝胶内部的通道容易进入无法进入凝胶内部的通道只能在凝胶外部移动路程较长移动速度较慢路程较短移动速度较快相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。4.凝胶色谱法分离蛋白质的原理和具体过程凝胶色谱法分离蛋白质过程的动画演示二、缓冲溶液在一定范围内，能够抵制对溶液PH值的影响，维持PH不变。1.作用:2.配制:通常由溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的就可以制得在使用的缓冲液。3.

3、提问：在本课题中使用的缓冲液是:__________,其目的是:利用缓冲液模拟细胞内的PH环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察(红色)和科学研究(活性)磷酸缓冲液外界的酸和碱基本1~2种缓冲剂使用比例不同PH范围内思考：说出人体血液中缓冲对。NaH2PO4/Na2HPO4H2CO3/NaHCO3三、电泳---血红蛋白的分离鉴定方法1.概念：带电粒子在作用下发生的过程。2.原理：许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有的基团，在一定的PH下，这些基团会带上或。在电场的作用下，这些带电分子会向着的的电极移

4、动。电泳利用了待分离样品中各种分子以及分子本身的、的不同，使带电分子产生不同的，从而实现样品中各种分子的分离。3.类型:琼脂糖凝胶电泳、聚丙稀酰胺凝胶电泳。电场迁移可解离正电负电与其所带电荷相反带电性质的差异大小形状迁移速度最常用的电泳支持介质是聚丙烯酰胺和琼脂糖凝胶。琼脂糖有一个相对较大的孔径，用来分离大分子例如核酸、大蛋白和蛋白复合物，聚丙烯酰胺形成孔径较小的胶，适合于分离大多数蛋白和小片段核酸。聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动琼脂糖凝胶电泳示意图电

5、泳检测PCR结果琼脂糖凝胶电泳（1）、蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于等因素。它所带静电荷的多少以及分子的大小（2）、SDS能与各种蛋白质形成蛋白质-SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有电荷量。因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于（）。分子的大小SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）①琼脂糖凝胶电泳操作简单，电泳速度快，样品不需要事先处理；电泳后区带易染色，样品极易洗脱，便于定量测定。②测定蛋白质的相对分子质量常用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，这是因为该方法

6、分离蛋白质完全取决于分子的大小，而非所带电荷的性质和分子的大小、形状。【典例1】有关凝胶色谱法和电泳法的说法正确的是A.它们都是分离蛋白质的重要方法B.它们的原理相同C.使用凝胶色谱法需要使用缓冲溶液而电泳不需要D.以上说法都正确【解题关键】解答本题的关键应明确以下两点：(1)凝胶色谱法的原理；(2)电泳法的原理。A二、实验步骤蛋白质的提取和分离一般分为四步：样品处理——粗分离——纯化——纯度鉴定（电泳）实验操作样品处理（一）蛋白质提取和分离步骤（二）操作过程红细胞的洗涤粗分离：血红蛋白的释放分离血红蛋白溶液纯

7、化：纯度鉴定透析—去除样品中分子量较小的杂质用凝胶色谱法除去相对分子质量较大的杂质SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳血液血浆水分其他物质：血浆蛋白、无机盐、磷脂、葡萄糖等血细胞白细胞血小板红细胞（最多）血红蛋白（90％）两个α－肽链两个β一肽链四个亚铁红素基团2.血液有哪些成分？1.用鸡的红细胞提取DNA，用哺乳动物的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于进行DNA的提取；人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富，便于提取血红蛋白。血红蛋白血红蛋白两个α－肽链两个β一肽链四个亚铁红

8、素基团每个肽链环绕一个亚铁血红素基团，此基团可携带一分子氧或一分子二氧化碳，血红蛋白因含有血红素而呈红色。血红蛋白的特点：采集得到血液（加入抗凝血剂柠檬酸钠）1、样品的处理（1）红细胞的洗涤A、洗涤目的:B、分离时采用离心，用洗涤，重复洗涤，直至C、能否用蒸馏水代替生理盐水？去除杂质血浆蛋白，以利于后续步骤的分离纯化低速短时间五倍体积的生理盐水三次上清液不再呈现黄色，表明红细胞已洗涤干